dingbuffer和ulannexinV-FITC和PI悬浮细胞。
黑暗条件下室温培养分钟后,用流式细胞仪记录V-FITC和PI绑定情况。
WesternBlot分析将培养在孔培养板上无周期性应变细胞刮入ul细胞溶解缓冲液(mMTris–HCl,pH.,mMNaCl,mMEDTA,NP-,.sodiumdeoxycholate,andL/mL蛋白酶抑制剂混合物;Pharmingen,BDBiosciences),样品在℃下rpm离心分钟澄清,然后加入含MmNaF辅助缓冲液中加热。
蛋白浓度取决于染色法(Bio-Rad实验室,Richmond,CA,USA),等样蛋白由SDS凝胶电泳中分离出并被转移到Immobilon-P聚偏二氟乙烯膜(MilliporeCorp.,Bedford,MA,USA),条带与特殊初级抗体和用IRDye和免疫球蛋白M抗体标记二级抗体杂交(Rockland,Gibertsvile,PA,USA).膜经冲洗几次后用波长umOdyssey红外成像系统扫描(LICOR,Lincoln,NE,USA),数据由Odyssey软件分析。
RNA干涉及抑制处理人体RhoGDIαmRNA序列由NCBIGenBank中获得。
作用于RhoGDIαsiRNA由上海GenePharma生物公司合成。
siRNA中针对RhoGDIα序列是(′→′)GAGAUAGUGUCCGGCAUGAdTdT和UCAUGCCGGACACUAUCUCdTdT′.根据厂商说明,经小时培养后,在RNA浓度达到nM时用Lipofectamine将siRNA转染入细胞。