在℃下经离心法收集细胞要分钟,和颗粒被冻结在-℃。
表达了他标记可溶性蛋白进行纯化下列先前描述协议[]。
PARN活性测定和动力学分析。
如所述前[],酶活性可以被亚甲蓝所测定。
作为时间函数脱腺苷酶率被确定用时间进程分析(图)。
亚甲蓝是由.mg亚甲蓝溶解在ml-吗啉基丙磺酸缓冲液中制备而成(.m-吗啉基丙磺酸-氢氧化钾,pH值.和mmEDTA)。
标准反应缓冲液含mg羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾(pH值.),.mg氯化镁,氯化钾mg,.ulRNA酶,.mg乙二胺四乙酸,.mgDTT,(v/v)甘油,.-.mg聚(A)。
所有核苷酸溶解在反应缓冲液后才能使用。
反应进行了利用.-.mm重组PARN。
对于动力学分析,底物浓度[聚(A)条]介于.至.mL[]。
最终反应容积为ul,反应是在℃进行-分钟。
反应终止是通过反应液和亚甲基