1、“.....放射免疫测定分为直接法与间接法。直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀,然后将沉淀分离并进行定量测定。其他方法主要有免疫抑制法化学发光免疫测定酶免疫测定荧光酶免疫测定等。国内曾有用免疫沉淀法单向扩散法测定酶活性的报告,如超氧化物歧化酶测定。二酶质量免疫化学测定法的优缺点与传统的酶活性测定法相比,免疫化学测定法的优点主要有灵敏度高,能测定样品中用原有其他方法不易测出的少量或痕量酶特异性高,几乎不受体液中其他物质,如酶抑制剂激活剂等的影响能用于些不表现酶活性的酶蛋白,如各种酶原或去辅基酶蛋白,或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定特别适用于同工酶的测定。酶免疫化学测定局限性要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的,且工作量较大测定步骤多,操作繁琐测定成本高。三同工酶检测临床同工酶或亚型的分析大致可分为两步,即首先精确地分离出酶的各同工酶或亚型组分,然后测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性的百分数,般选用......”。
2、“.....即指在所选择应为零级反应,第二个反应为级反应。如测定时间很短,浓度不高时,指示酶催化反应速率可通过下列公式进行计算式中表示延滞时间,为指示酶的米氏常数,是在时产物为其稳态浓度催化反应速率的计算公式为式中为测定酶的测定上限,为指示酶的米氏常数,为中间产物浓度。介绍的另种近似计算法计算延滞期时所需指示酶的量。假定酶偶联反应如下第个反定的吸光度变化指示酶的选择指示酶的用量测定酶的测定上限分别是测定酶指示酶的米氏常数米曼氏方程在酶偶联反应中,指示酶水平,指示酶反应速度也较低,不能代表测定酶的反应速率。稳态期产物增加到定程度时,和催化的反应速率相同,达到了稳态期。此阶段特定波长处如吸光度才会有明显的线性变化。酶偶联法测加的酶称为辅助酶。偶联反应中存在几个时相预孵育期反应开始只存在底物,不存在指示酶的反应。延滞期加入底物启动反应,在启动后的段短时间内,产物开始出现并逐渐增加,但仍处于较低称为指示反应。如果些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联......”。
3、“.....将二者连接起来,此反应称为辅助反应。模式为般习惯将最后个酶称指示酶,其他外用酶偶联反应是间接法测定酶活性的主要技术特点。最简单的酶偶联反应单底物反应且只有个工具酶模式为被测定酶被检测物质指示酶催化的反应称为始发反应,产生被检测物质产物的反应止酶促反应条件下,直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度荧光旋光性电导率粘度等计算出酶活性浓度。只有底物与产物之间,在理化性质等方面有显著差异时,才能使用直接法。间接法采滞期和级反应。定时法中可能引起的误差二连续监测法测定酶活性连续测定酶反应过程中反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据,求出酶反应初速度,间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。直接法在不终的生成量计算酶活性,这是早期测定酶活性浓度的方法。用定时法准确测定酶活性浓度,必须了解不同酶促反应速率和时间的关系,应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期,确定线性时间,然后在这段时间进行测定......”。
4、“.....最好此时呈级反应,反应初速度。如果能准确测定反应的初速度,采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。酶活性测定酶学测定方法酶质量测定固定时应考虑以下问题工具酶的特异性大小要合适酶的用量工具酶中的杂酶应低于允许限。反应平衡点附加剂应不抑制酶的活性动力学法根据米氏方程,当,般应远小于其米氏常数,此时任何时刻的反应速率,呈级反应反应配方中所用酶量应足够大,而应小,以保证有较快的反应速度完成测定。终点法测定的实验设计中,主要的改变来进行定量分析酶偶联法如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分,则可将反应产物偶联到另个酶促反应中,而达到检测的目的,即为酶偶联法。代谢物酶促终点法测定的基本条件是待测物浓度的改变来进行定量分析酶偶联法如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分,则可将反应产物偶联到另个酶促反应中,而达到检测的目的,即为酶偶联法......”。
5、“.....此时任何时刻的反应速率,呈级反应反应配方中所用酶量应足够大,而应小,以保证有较快的反应速度完成测定。终点法测定的实验设计中,主要应考虑以下问题工具酶的特异性大小要合适酶的用量工具酶中的杂酶应低于允许限。反应平衡点附加剂应不抑制酶的活性动力学法根据米氏方程,当,般,最好此时呈级反应,反应初速度。如果能准确测定反应的初速度,采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。酶活性测定酶学测定方法酶质量测定固定时间法连续监测法第二节酶测定技术酶活性测定定时法测定酶活性二连续监测法测定酶活性三干扰因素四血清酶活性浓度测定的条件的优化五部分分析前因素对酶活性测定的干扰六酶活性浓度的单位七系数值的计算与应用八临床酶学测定的标准化定时法测定酶活性定时法是根据固定时间内底物消耗量或产物的生成量计算酶活性,这是早期测定酶活性浓度的方法。用定时法准确测定酶活性浓度,必须了解不同酶促反应速率和时间的关系,应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期,确定线性时间,然后在这段时间进行测定,避开延滞期和级反应......”。
6、“.....求出酶反应初速度,间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。直接法在不终止酶促反应条件下,直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度荧光旋光性电导率粘度等计算出酶活性浓度。只有底物与产物之间,在理化性质等方面有显著差异时,才能使用直接法。间接法采用酶偶联反应是间接法测定酶活性的主要技术特点。最简单的酶偶联反应单底物反应且只有个工具酶模式为被测定酶被检测物质指示酶催化的反应称为始发反应,产生被检测物质产物的反应称为指示反应。如果些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联,此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另种酶,将二者连接起来,此反应称为辅助反应。模式为般习惯将最后个酶称指示酶,其他外加的酶称为辅助酶。偶联反应中存在几个时相预孵育期反应开始只存在底物,不存在指示酶的反应。延滞期加入底物启动反应,在启动后的段短时间内,产物开始出现并逐渐增加,但仍处于较低水平,指示酶反应速度也较低,不能代表测定酶的反应速率。稳态期产物增加到定程度时,和催化的反应速率相同......”。
7、“.....此阶段特定波长处如吸光度才会有明显的线性变化。酶偶联法测定的吸光度变化指示酶的选择指示酶的用量测定酶的测定上限分别是测定酶指示酶的米氏常数米曼氏方程在酶偶联反应中,指示酶催化反应速率的计算公式为式中为测定酶的测定上限,为指示酶的米氏常数,为中间产物浓度。介绍的另种近似计算法计算延滞期时所需指示酶的量。假定酶偶联反应如下第个反应为零级反应,第二个反应为级反应。如测定时间很短,浓度不高时,指示酶催化反应速率可通过下列公式进行计算式中表示延滞时间,为指示酶的米氏常数,是在时产物为其稳态浓度的百分数,般选用。三干扰因素其他酶和物质的干扰酶的污染非酶反应分析容器的污染沉淀形成四血清酶活性浓度测定的条件的优化测定酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶促反应的“最适条件”,即指在所选择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大。主要与下述些因素有关如底物辅因子活化剂缓冲液和变构剂种类和浓度指示酶和辅助酶的种类和浓度反应混合液的和离子强度其他可变因素,如已知抑制剂的去除。方法选择尽可能采用连续监测法尽量减少操作步骤......”。
8、“.....试剂化学试剂必须具有定纯度试验用水最好是纯水或双蒸水。自动生化分析仪参数的设臵方法类型终点法或连续监测法。反应方向分正向向上吸光度增加或负向向下吸光度减低。波长选择酶促反应体系吸光度最大的波长样品量与试剂量应考虑测定的灵敏度和测定上限选用合适的样品与试剂体积比。般推荐样品与试剂体积连续监测法磷酸对硝基苯酚法岁男岁,岁女岁比色法磷酸麝香草酚法连续监测法,即法,即法连续监测法酶偶联法男女连续监测法谷氨酰羧基对硝基苯胺法连续监测法谷氨酰对硝基苯胺法男女男女连续监测法对硝基苯麦芽庚糖苷法固定时间法乳化液比浊法连续监测法丁酰硫代胆碱法七系数值的计算与应用在实际工作中,特别是用自动生化分析仪测定同酶,条件固定时,从理论上来讲和均为固定值,ε为常数,则将上述公式可简化为为酶活性浓度定量系数或称为常数,主要用于临床酶活性测定的计算与校准。系数值的意义与设臵系数值对于酶的测定十分重要,过高虽然测定的线性较宽,但重复性差,反之,虽然精密度好,但检测线性窄。值的设臵应考虑测定酶的参考范围上限及测定时间两方面,以保证测定结果的可靠......”。
9、“.....不能直接用于酶活性浓度的计算。常用指示物的摩尔消光系数与用途指示物主波长次波长用途εε测等εε测对硝基苯酚εε测对硝基苯胺ε测硫代硝基苯甲酸εε测八临床酶学测定的标准化标准化途径通过使用推荐方法和参考方法,以及使用公认的酶校准物或酶参考物等,使酶学测定标准化。使用推荐方法和参考方法我国于年发表了测定人血清血浆中酶催化浓度方法总则,并于年年相继通过了项推荐方法草案。卫生行业标准临床酶活性浓度测定方法总则编号也已由卫生部批准实施。使用公认的酶校准物或酶参考物酶测定中最理想的校准方法是用稳定的定值准确的酶校准物或酶参考物对测定全过程进行校准。酶活性浓度测定的参考系统于年决定建立包括下列要素的测定酶催化浓度的参考系统参考测定方法,以现有的的参考方法作为基础,制定了套的标准操作方法参考实验室网络,选择组参考实验室包括厂家实验室,为之提供必要的技术和仪器,使之在计量学高水平上按参考测定方法进行测定参考物,参考实验室网络对现有的参考物进行重新认证......”。
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