1、“.....遗传标记基因的去除为后续研究中还要在突变株的基础上再次敲除基因，需要删除突变株的抗性基因。本研究采用报告基因挽救系统剔除遗传标记基因。系统是由重组酶及其识别序列位点组成。通过在靶序列引入标记基因和两侧的位点，以酶位点发生特异性重组，从而实现靶基因结构部分或者全部被破坏，使其不能正确表达产物。质粒中遗传标记基因的两端有两个位点，质粒中含有重组酶基因，能够将两个位点之间的序列切除，这样在原位点上就只留下个位点，突变株由于丢失遗传标记基因而丧失了抗性标记功能......”。

2、“.....并用抗性平板筛选转化子。将携带有质粒的转化子在半乳糖培养基中诱导表达左右，梯度稀释后取适量菌液涂布于平板，待长出单菌落后，对应点种到无的平板和含有的平板上，培养。如图所示，在无平板上可以生长但在含有平板上不能生长的单菌落就是抗性基因丢失了的酵母转化子。天津科技大学硕士学位论文图抗性基因丢失菌株的点种反选平板抗性平板基因去除突变株的验证随机筛选在无平板上可以生长但在含有平板上不能生长的酵母突变株，命名为。提取突变株和的基因组，并以此基因组为模板，利用引物和进行扩增......”。

3、“.....经琼脂糖凝胶电泳图，泳道和与预期大小致，进步证明突变株基因组上的抗性基因已被成功剔除。图基因丢失验证为了保证突变株的遗传稳定性，需丢失其导入的质粒。将突变株于液体培养基中传代培养，传代十次后，选取第代及第十代提结果与讨论取酵母质粒，然后以提取的酵母质粒作为模板，利用引物与进行扩增，验证质粒是否丢失。由图可知从第代酵母质粒上可扩增出左右大小的抗性基因片段，而从第十代酵母质粒上则扩增不出，证明突变株中的质粒已丢失。图质粒丢失验证第代第十代经黄酒发酵验证......”。

4、“.....小结与讨论将基因个等位基因敲除的突变株与出发菌株进行黄酒发酵实验，发酵结果表明，与出发菌株相比，突变株的基本发酵性能无明显变化，保持了黄酒酵母快速发酵的优良发酵特性。同时气相色谱检测结果显示，基因个等位基因敲除的突变株黄酒发酵所产生的异戊醇含量出现了明显的下降。突变株去除抗性基因后，得到的突变株的基本发酵性能和产高级醇含量与相比基本保持不变。基因的敲除能够显著降低异戊醇的生成量这实验结果与等人的研究结果相同。基因编码的天冬氨酸半醛脱氢酶是苏氨酸和蛋氨酸生物合成途径中的关键酶......”。

5、“.....是高级醇代谢途径中的重要酶。基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响重组质粒的构建目的片段的扩增为了提高同源重组效率，缩进设计同源臂，以基因的部分分别命名为片段和片段作为同源臂。以黄酒酵母基因组为模板，利用对引物天津科技大学硕士学位论文和扩增片段，利用引物和扩增片段，电泳检测扩增片段，结果如图所示。扩增出的片段均与预期大小致，说明扩增结果都正确。图片段的产物,重组质粒的构建流程重组质粒的构建流程如图，将纯化的片段用和进行双酶切......”。

6、“.....构建重组质粒。将纯化后的片段用和进行双酶切，与经同样酶切后的连接，构建重组质粒。将基因片段用进行单酶切，与经同样酶切并去磷酸化回收的质粒连接，最终构建重组质粒。重组质粒的验证根据重组质粒的构建流程,分别将重组质粒和进行酶切验证，电泳检测目的片段，结果如图。将重组质粒经和双酶切，获得和大小的特异性条带将重组质粒经和双酶切，获得和大小的特异性条带将重组质粒经单酶切，获得和大小的特异性条带，这些片段大小均与预期结果致，基本证明重组质粒构建成功，然后将质粒送往测序公司进行基因测序......”。

7、“.....其中与和连接方向相反。结果与讨论图重组质粒的构建流程图图重组质粒和的酶切验证天津科技大学硕士学位论文基因两个等位基因敲除的突变株的获得及验证重组片段的获得以构建好的重组质粒为模板，利用引物和扩增的重组片段，检测目的片段，结果如图。结果显示扩增产物单，特异性条带大小正确。图重组片段的产物突变株的获得及验证通过醋酸锂转化法将重组片段导入突变株中，通过同源重组过程实现了基因部分片段被基因完全替换，从而实现基因的部分敲除。挑取平板上长出的转化子于含有的液体培养基中培养，并提取其基因组......”。

8、“.....进行验证。利用引物和可从转化子中扩增出大小为的上游验证产物图，泳道，利用引物和可从转化子中扩增出大小为的下游验证产图，泳道，而出发菌株则无扩增产物图，泳道和，扩增出的产物大小与预期相同，此结果说明基因片段已经成功整合到突变株基因组上，即基因两个等位基因敲除的突变株构建成功，命名为。而且以引物和进行扩增，从突变株基因组上已经不能扩增出基因，说明突变株中的基因已经被全部敲除。结果与讨论图突变株的验证以的基因组为模板，以和为引物进行扩增的产物以的基因组为模板，以和为引物进行扩增的产物以的基因组为模板......”。

9、“.....以和为引物进行扩增的产物突变株与出发菌株生长性能的比较按照方法测定基因两个等位基因敲除的突变株与基因个等位基因敲除的突变株及出发菌株的生长曲线。从图可以看出，突变株和出发菌株都经历了延滞期对数期和稳定期个阶段。其中突变株和的整体生长趋势和菌体密度与出发菌株都基本保持致，而突变株的生长繁殖进入对数期后，繁殖速度明显比突变株和出发菌株慢，说明基因个等位基因敲除对菌株的生长繁殖没有明显影响，而基因两个等位基因敲除会严重抑制菌株的生长繁殖......”。