优化年，等通过化学改造得到了系列可以同时抑制蛋白酶和蛋白酶的醛类抑制剂，其中有个类似物化合物和抗的活性在微摩尔浓度肽磺酸钠类抑制剂用于猫的冠状病毒感染治疗药物化合物，图是种广谱的病毒蛋白酶抑制剂，分子结构中的磺酸盐易离去，生成醛类的活性中间体，进而抑制蛋白酶的活性等考察了和对蛋白酶的抑制活性，分别为和年，课题组为了获得高活性的抗药物，解析了与蛋白酶的复合物晶体结构在此基础上，该团队在位引入了取代的哌啶基团，方面可以增强化合物与口袋的结合，另方面还可以改善化合物的溶解性其中，化合端未被水解的蛋白酶活性和聚能力较其母体有了很大的提高，将通过分子间作用进步水解端自切位点最后，随着具有自由的端和端的野生型蛋白酶单体浓度的升高，单体组装成活性形式的聚体蛋白酶成熟过程中的底物诱导机制提供了种酶活性调控和病毒组装的可能方式在病毒复制初期，只有微量的酶或底物，底物的诱导使酶活化随着酶催化反应的进行，底物浓度不断减少，成熟蛋白酶不断增加，促使更多的活性聚体产生以及底物的进步消耗至殆尽病毒这种调控方式在酶活控制和底物的利用方面非常高效经济除了蛋白酶外，可能还有更多的多结构域蛋白酶采用这种调控方式图蛋白酶抑制剂研究蛋白酶的结构与功能研究为靶向药物设计奠定了基础随着计算机模拟技术和化合物筛选技术的飞速发展，目前已有大量具有蛋白酶和蛋白酶抑制活性的合成化合物和天然产物报道，但遗憾的是尚没有进入临床阶段的化合物亟需在这些工作的基础上寻找更有效的新冠治疗药物在小节中，我们对目前已报道的蛋白酶和蛋白酶抑制剂进行梳理，总结分析其结构与活性关系及可能的作用机制在蛋白酶抑制剂的最新发现希望能够为的治疗药物研发提供参考图蛋白酶活性调控机制网络版彩图蛋白酶和蛋白酶抑制剂的研究进展根据其结构和来源，抑制剂可以分为短肽类抑制剂有机小分子抑制剂天然产物抑制剂和金属配合物等根据化合物与蛋白酶催化活性位点的作用模式，又可分为共价结合型或非共价结合型共价结合型抑制剂主要与蛋白酶活性部位的巯基形成共价键使其失活，这类抑制剂分子中通常含有个亲电中心，能够接受原子的亲核进攻而非共价结合抑制剂大多为底物竞争型抑制剂，也有少数分子结合在蛋白酶的聚界面上短肽类抑制据端和端自切效率提出了成熟路径的数值模型他们认为，多聚蛋白自切第步在端和端都有可能发生，只是发生在端自切的概率更大本课题组等发现，底物有增强蛋白酶聚的作用蛋白酶的聚体结合能力比较弱，超速分析型离心方法得出纯蛋白酶的聚解离常数为，在发生酶催化反应时聚推测的解离常数为，表明底物可以诱导蛋白酶聚选用底物类似物萘甲基靛红甲酰胺测定蛋白酶在不同浓度下聚体含量，发现同样可以诱导蛋白酶聚研究结果表明，随着底物浓度的升高，蛋白酶会形成更多的聚体，而聚体含量的提高又反过来提高酶的活性，这种双向别构调控机制有可能是病毒用来调控多聚蛋白水解速率和组装时机的种方法等随后也报道了底物可以增强蛋白酶突变体聚的现象底物诱导蛋白酶聚的调控方式在蛋白酶中也被报道蛋白酶聚能力较蛋白酶更弱，超速分析型离心法测得蛋白酶解离常数为，且亚基之间的交换速率很慢为族和蛋白酶的，为家族蛋白酶的等认为，蛋白酶聚体的形成是通过非保守氨基酸的长程作用调控的蛋白酶在酶促反应中解离常数为，聚能力约为纯蛋白酶的倍，这表明酶促反应中底物诱导了蛋白酶形成聚体超速分析型离心结果表明，蛋白酶与两个肽类抑制剂号化合物和号化合物分别混合后，沉降系数由从单聚体向聚体移动，并且号化合物在低浓度时可激活蛋白酶活性基于上述结果，他们提出了蛋白酶的成熟机制，比等的更加具体化多聚蛋白端的切割需要形成瞬时聚体并且在聚体分子内完成，端的切割在聚体分子间完成，成熟的冠状病毒蛋白酶活性调控机制及抑制剂研究新型冠状病毒点为小的脂肪族氨基酸，主要为丝氨酸和丙氨酸在人类的蛋白中尚未发现具有相似底物特异性的蛋白酶，因此针对蛋白酶的药物设计造成脱靶的可能性较小，位点的保守性为靶向蛋白酶的药物设计提供了关键信息虽然冠状病毒蛋白酶底物识别序列高度保守，但不同病毒来源的蛋白酶底物也存在细微差别研究发现，蛋白酶的口袋比和蛋白酶小，只能容纳偏小的疏水氨基酸，主要为亮氨酸，甲硫氨酸次之，未发现苯丙氨酸，这也是目前已知的组冠状病毒蛋白酶的共性而在和蛋白酶底物位臵除外，苯丙氨酸的比例有所提升本课题组等发现，蛋白酶的个天然底物酶切位点中，源自蛋白酶端的自我切割点效率最高，端次之，这意味着在多聚蛋白中蛋白酶首先完成自我成熟圆色谱研究结果表明，多肽底物形成类似折叠的伸展构象利于酶水解反应为了进步详细研究底物特异性并为抑制剂设计提供更多信息等合成了个截短和突变的底物肽，发现位点端的残基对反应活性的影响比端显著，和位臵的残基对于底物识别和结合至关重要，提高和位臵的折叠构象倾向有助于酶与底物的结合和水解此外，位点的正电荷可能在酶的位和之间形成盐桥会增加酶的反应活性因此抑制剂设计中需充分考虑分子刚性对和口袋结合的专性，来提高抑制剂的选择性和活性他们根据底物选择性特征设计了个肽底物，此底物被水解的效率比端自切序列提高了倍等分析了冠状病毒和家族蛋白酶的底物特异性得出与本课题组上述研究相似的结论，他们也根据有利于底物水解的特征组合设计并得到了两个水解活性高于天然底物倍的肽底物图和蛋白酶多聚蛋白酶中不能插到结构域和之间的界面中破坏了与的相互作用，使得结构域不能精确定位，从而触发蛋白酶从聚体向单体的转换使得催化中心的氧阴离子孔坍塌，通过长程作用影响了蛋白酶聚除外，和几乎没有活性，而的残留活性是因为溶液存在少部分聚体叠合和的晶体结构发现，结构域比野生型偏离约，这种偏离在其他冠状病毒如传染性支气管炎病毒，和蛋白酶的单体结构中也有报道蛋白酶中连接结构域和结构域的柔性区介导了结构域的定位，这表明蛋白酶可能具有很大的结构可塑性，使得蛋白酶在聚体和单体形式之间转换另外，对比与野生型蛋白酶的活性构象发现，肽段的结构明显不同是氧阴离子孔的部分，参与维持活性酶中底物结合口袋的正确构象在活性构象中此肽采取无规结构而在无活性的构象中此肽形成了短螺旋结构，扭曲了氧阴离子孔这种螺旋结构在蛋白酶单体中也存在本课题组等将突变为，破坏了单体中的螺旋结构，部分改善了底物结合口袋构象，最终获得了个具有定酶活性的单体突变体，证实了该肽的结构对于酶活性的关键调控作用蛋白酶催化反应机理胰凝乳蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶，酶催化活性中心由丝氨酸组氨酸天冬氨酸联体构成蛋白酶具有类胰凝乳蛋白酶结构，其活性中心由半胱氨酸和组氨酸构成本课题组等，的研究表明，蛋白酶虽然活性部位的关键残基之为半胱氨酸，但其底物水解过程遵循丝氨酸蛋白酶催化机理蛋白酶活性中心突变为后完全失活，突变为后仍有水解活性使用底物显色法测得野生型蛋白酶和突变体端的大部分位点，对多聚蛋白的成熟起主要作用，是病毒复制繁殖的关键酶它们在冠状病毒中高度保守，是抗冠状病毒疾病的重要药物设计靶点对该酶的结构与调控机制研究是寻找针对蛋白酶为靶标的抗冠状病毒药物的基础，也为深入理解蛋白质在生命活动中的多样性和重要性提供了线索蛋白酶结构与功能已报道的冠状病毒蛋白酶晶体结构均为同源聚体，构成聚体的亚基包含个结构域图端为类似胰凝乳蛋白酶结构的两个折叠结构域和形成的催化结构域，由半胱氨酸和组氨酸构成的催化联体位于结构域和形成的裂隙中端为个由个螺旋形成的结构域，又被称作螺旋结构域或结构域，通过柔性环状结构与催化结构域相连，主要参与蛋白酶的聚蛋白酶在溶液中存在单体聚体的平衡，使用凝胶过滤分析型超速离心等温滴定量热酶动力学等方法测出的解离常数有较大差别，范围从纳摩尔到微摩尔不等其中等等和等使用了相同的测量方法和拟合算法超速分析离心方法和全局拟合算法，分别测得蛋白酶聚体的解离常数为和等也同时测得蛋白酶的解离常数，与他们报道的蛋白酶解离常数相同，均为等测得的略有不同，这可能与不同实验室表达的蛋白酶端不完全致有关蛋白酶的活性形式已被证实为聚体，且同时刻聚体中只有个单体有活性，图蛋白酶晶体结构网络版彩图等将已解出的个不同冠状病毒的蛋白酶晶体结构进行叠合分析，发现催化结构域和以及位于和之间的底物结合口袋在所有蛋白酶中高度保守，这为靶向该蛋白酶活性口袋的广谱药物设计提供了结构基础聚体结构中的两个亚基在空间取摘要由冠状病毒感染引发的全球性疫情对人类健康造成了巨大威胁，时至今日尚未有特效的治疗药物或疫苗问世，因此开发具有临床应用价值的抗冠状病毒药物刻不容缓蛋白酶在冠状病毒的复制过程中起关键作用，其序列具有高度保守性，是进行抗冠状病毒药物设计的关键靶标本文围绕和蛋白酶的结构与功能关系已报道抑制剂的结构类型与活性及可能的作用机制进行归纳总结，探讨蛋白酶抑制剂研发的新方向，为抗新型冠状病毒药物研发提供参考关键词蛋白酶冠状病毒抑制剂新型冠状病毒新型冠状病毒肺炎特效的治疗药物研发引言年底暴发的新型冠状病毒肺炎在随后几个月内迅速演变成全球性的突发公共卫生事件，截至年月日已有超过万余人确诊感染新型冠状病毒，死亡人数超过万目前治疗以支持疗法为