1、“.....尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。如蛋氨酸和色氨酸均只有个密码子。，充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。，引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物末端不要位于密码子的第三位。④，在简并度高的位置，可用次黄嘌呤代替简并碱基。以上几点，遵循的总的原则为尽量降低引物的简并度，尤其在末端或近末端。用对简并引物扩增类分子时，同样遵循上述总的原则，即尽量降低引物的简并度，尤其在末端或近末端。在此种应用中，应先利用工具软件多序列对准比较软件或其它工具找到这些分子的保守区，然后根据共有序列，应用上面所述的些原则来设计所需要的引物。引物设计及软件使用技巧摘要本文旨在介绍使用软件设计引物的技巧。在引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。般性引物自动搜索可采用软件......”。

2、“.....自从年发明了聚合酶链式反应以来，技术已成为分子生物学研究中使用最多最广泛的手段之，而引物设计是技术中至关重要的环。使用不合适的引物容易导致实验失败表现为扩增出目的带之外的多条带如形成引物二聚体带，不出带或出带很弱，等等。现在引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。般来说，专门进行引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。引物设计的原则引物设计有条基本原则首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发聚合反应即错配。具体实现这条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度，产物长度，序列值，引物与模板形成双链的内部稳定性,用值反映......”。

3、“.....在错配位点的引发效率，引物及产物的含量，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点引物的长度般为，常用的是，但不应大于，因为过长会导致其延伸温度大于，不适于聚合酶进行反应。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物端出现个以上的连续碱基，如或，也会使引发机率增加。引物端的末位碱基对酶的合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为的错配效率明显高于其他个碱基，因此应当避免在引物的端使用碱基。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致反应失败。端序列对影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。引物序列的含量般为，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的含量不能相差太大。引物所对应模板位置序列的值在左右可使复性条件最佳......”。

4、“.....如按公式，在软件中使用的是最邻近法。值是指双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用端值较低绝对值不超过，而端和中间值相对较高的引物。引物的端的值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高超过易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使反应不能正常进行。对引物的修饰般是在端增加酶切位点，应根据下步实验中要插入产物的载体的相应序列而确定。值得提的是，各种模板的引物设计难度不。有的模板本身条件比较困难，例如含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物在用作克隆目击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至序列即可。对简并引物的分析不需像般引物那样严格。总之，有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析......”。

5、“.....是个相当不错的软件。使用技巧简介功能在专门的引物设计软件中，是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。的初始界面是两个图图和图的界面更复杂，出现三个图，加了个图。的功能比还要单，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。使用以为例的启动界面如下图中显示的三个指标分别为和，其中是版本的新功能，为邻近至个碱基组成的亚单位在个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的排列方式不太方便，可从菜单改为方式。如果觉得太拥挤，可去掉个指标，如，这样界面的结构同于，只是显示更清楚了。经过项后的显示如图在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击图块上左下角的按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成......”。

6、“.....最好引物的值在端和中间值比较高，而在端相对低如图值曲线以选取附近为佳，到的下降形状也有利于引物引发聚合反应。曲线为新引进的个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用端值相对较低的片段。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。般的检测非克隆性，对引物位置产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。般来说，这两项结构的能值以不超过为好。当然，在设计克隆目的的引物时，引物两端般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果......”。

7、“.....第三项检查为含量，以为宜。有些模板本身的含量偏低或偏高，导致引物的含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的含量以及值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果的模板不是基因组，而是个特定模板序列，那么最好还进行的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的结果。般在错配引发效率以不超过为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为以上，而在位点的引发效率为，那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按键弹出窗口，其中总结性地显示该引物的位置产物大小值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。由于软件的引物自动搜索功能与的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实......”。

8、“.....如果参数设置得当将大大提高工作效率。除了本地引物设计软件之外，现在还有些网上引物设计软件，如由开发的等本网站已引进并调试好该软件，欢迎使用。该软件的独特之处在于，对全基因组的引物设计可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组的用户试用的因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。引物的自动搜索和评价分析软件的引物设计功能主要体现在两个方面首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以最优秀其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以为最强且方便使用，其次，其他软件如和都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物......”。

9、“.....笔者认为引物设计软件的最佳搭配是和软件合并使用，以进行自动搜索，进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。的使用技巧简介功能的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计限制性内切酶位点分析和基元查找。还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列朗读与蛋白序列的互换语音提示键盘输入等等。有时需要根据段氨基酸序列反推到来设计引物，由于大多数氨基酸种常见结构氨基酸中的种的遗传密码不只种，因此，由氨基酸序列反推序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不样的。可以针对模板的来源以相应的遗传密码规则转换和氨基酸序列......”。