1、“.....测序,确认被完整的克隆,再经双酶切获得片段。由于载体和基因中同时都含有酶切位点,因此在双酶切质粒时,大部分的基因选。而利用商业化的表达质粒无法产生双交换事件,为了同时利用启动子进行组成型表达筛选,以及将外源基因双交换整合入基因组产生单拷贝重组子,本文在保留了诱导型表达载体上的的基础上,将得到的基因片段插入到序列之后,华根霉脂肪酶基因之前,通过载体与基因组之间的及区发生的双交换事件,将构建的组成型表达载体整合到酵母基因组中,产生表型的菌株。双交换的发生导致基因组中编码区完全被取代,不能发挥启动子的作用,只作为双酿造浓香型大曲酒酒曲中筛选获得的华根霉中克隆得到其脂肪酶基因登录号,并在毕赤酵母中实现了克隆与高效表达。研究所用的表达载体含有个来自于乙醇氧化酶基因的严格甲醇诱导型的强启动子,但甲醇易燃,在工业放大过程中存在安全隐患。是种糖酵解中的关键酶磷酸甘油醛脱氢酶,的启动子......”。

2、“.....能高效地组成型表达外源基因,在培养过程中不需更换碳源,简化了操作步骤,也更适和重组毕赤酵母由本实验室构建,巴斯德毕赤酵母载体购自公司。酵母的电转化将构建的组成型质粒经限制性内切酶酶切后,胶回收得到大片段线性化质粒,电转化毕赤酵母感受态细胞取浓度为的线性化质粒与感受态细胞混合均匀,转至冰预冷的电激杯中。冰上放臵,电压,电容,电阻,进行电击。立刻加入山梨醇复苏,培养。将转化液涂布于平板上,培养。的农业水利论文酵母成型脂肪酶筛选方法建的组成型表达菌株点种于橄榄油罗丹明平板上,培养,在紫外光下观察单菌落变色圈情况。单插入和双交换筛选库的构建利用定向进化技术建立的基因突变文库的质量将对后续的实验结果有重大影响。为考察单插入与双交换这两种不同的整合方式对整个建库的影响,将经酶切的线性化对照质粒和经酶切的线性化重组质粒分别通过单插入和双交换方式整合进毕赤酵母基因组中......”。

3、“.....进行电转化。将获得的诱导型转基因片段插入到序列之后,华根霉脂肪酶基因之前,通过载体与基因组之间的及区发生的双交换事件,将构建的组成型表达载体整合到酵母基因组中,产生表型的菌株。双交换的发生导致基因组中编码区完全被取代,不能发挥启动子的作用,只作为双交换整合的必需元件。从而导致紧随其后的启动子能够顺利的发挥组成型表达华根霉脂肪酶的作用。该表达体系显著减少毕赤酵母基因多拷贝的产生概率,并能够组成型表达外源基因。以华根霉脂肪酶为研究载体,利用该表达体系组成型表达华根霉脂肪酶,结合质粒时,大部分的基因也被切除,因此需要将个片段连接起来。如图所示,双酶切质粒后将长片段与连接,构建质粒。再用酶切线性化质粒,将片段补回表达质粒中。由于线性化的质粒过长,酶切位点容易自连,需要先进行去磷酸化处理,再连接基因,最终得到含的组成型表达载体......”。

4、“.....在工业放大过程中存在安全隐患。是种糖酵解中的关键酶磷酸甘油醛脱氢酶,的启动子,在葡萄糖甘油等基本碳源的存在条件下,能高效地组成型表达外源基因,在培养过程中不需更换碳源,简化了操作步骤,也更适合工业上的应用,因此我们考虑利用启动子来构建组成型表达的载体。外源基因整合入毕赤酵母,根据线性化位点位臵的不同,将会导致两种整合入基因组事件单插入与双交换的发生,产生两种不同的表型,即和。单插入事件通常罗丹明培养基按照生物素橄榄油琼脂的比例配臵后,灭菌,灭菌后冷却至,加入过滤灭菌的罗丹明,制成平板。方法启动子的克隆根据上的的序列,设计对专性引物下划线为酶切位点下划线为酶切位点。以载体为模板,扩增启动子序列。扩增条件导致插入不同拷贝数的基因组,而双交换般是将单拷贝外源基因整合入基因组。多拷贝外源基因的整合可以提高外源蛋白的表达量......”。

5、“.....多拷贝的发生会干扰重组子的筛选,例如筛选酶活提高突变株时,拷贝数的增加也会导致酶活增高,从而干扰了酶活提高突变酶的筛选。而利用商业化的表达质粒无法产生双交换事件,为了同时利用启动子进行组成型表达筛选,以及将外源基因双交换整合入基因组产生单拷贝重组子,本文在保留了诱导型表达载体上的的基础上,将得到的重组子拷贝数的定量每个文库随机挑选株阳性转化子,提取基因组,利用荧光定量技术进行基因拷贝数的定量。结果与分析表达载体的构建以质粒为模板,利用和引物获得启动子,同时在中引入和酶切位点。产物条带约图。连接载体,测序,确认被完整的克隆,再经双酶切获得片段。由于载体和基因中同时都含有酶切位点,因此在双酶切质粒时,大部分的基因点种于橄榄油罗丹明平板上,培养,在紫外光下观察单菌落变色圈情况......”。

6、“.....将经酶切的线性化对照质粒和经酶切的线性化重组质粒分别通过单插入和双交换方式整合进毕赤酵母基因组中,同时保证这两种线性化质粒的量基本相同,进行电转化。将获得的诱导型转化子涂布平板,将的毕赤酵母高通量筛选方法橄榄油罗丹明平板变色圈法指利用橄榄油作为底物,用作为指示剂,通过脂肪酸与结合在紫外光下进行观察,平板上产生荧光变色圈来判断脂肪酶活力。如图所示,菌株未插入脂肪酶基因而生长缓慢,不产生荧光变色圈,只有菌株才能在平板上正常生长,它能直接以橄榄油作为碳源表达脂肪酶,因此菌落较大且紫外条件下荧光变色圈大而明显。该结果为进步利用该筛选系统进行定向进化奠定了基础。单插入和双交换对转化效率拷贝数和筛选时橄榄油罗丹明平板显色法,建立了定向进化突变文库的高通量筛选方法。材料与方法材料工具酶和试剂限制性内切酶碱性磷酸酶连接酶聚合酶试剂载体......”。

7、“.....菌株和质粒由本实验室保存。重组质粒导致插入不同拷贝数的基因组,而双交换般是将单拷贝外源基因整合入基因组。多拷贝外源基因的整合可以提高外源蛋白的表达量,但是利用毕赤酵母表达系统进行定向进化的过程中,多拷贝的发生会干扰重组子的筛选,例如筛选酶活提高突变株时,拷贝数的增加也会导致酶活增高,从而干扰了酶活提高突变酶的筛选。而利用商业化的表达质粒无法产生双交换事件,为了同时利用启动子进行组成型表达筛选,以及将外源基因双交换整合入基因组产生单拷贝重组子,本文在保留了诱导型表达载体上的的基础上,将得到的建的组成型表达菌株点种于橄榄油罗丹明平板上,培养,在紫外光下观察单菌落变色圈情况。单插入和双交换筛选库的构建利用定向进化技术建立的基因突变文库的质量将对后续的实验结果有重大影响......”。

8、“.....将经酶切的线性化对照质粒和经酶切的线性化重组质粒分别通过单插入和双交换方式整合进毕赤酵母基因组中,同时保证这两种线性化质粒的量基本相同,进行电转化。将获得的诱导型转共个循环。重组子拷贝数的定量每个文库随机挑选株阳性转化子,提取基因组,利用荧光定量技术进行基因拷贝数的定量。结果与分析表达载体的构建以质粒为模板,利用和引物获得启动子,同时在中引入和酶切位点。产物条带约图。连接载体,测序,确认被完整的克隆,再经双酶切获得片段。由于载体和基因中同时都含有酶切位点,因此在双酶切农业水利论文酵母成型脂肪酶筛选方法平板上的单菌落用灭菌牙签挑至板上,诱导后,顶层琼脂法染色,内能够显出明显棕黑色的菌株为阳性重组菌脂肪酶可以水解萘酯,水解产物与染料结合显色。阳性重组率所有板上诱导表达产脂肪酶的单菌落数板上的单菌落数。将获得的组成型转化子涂布橄榄油罗丹明平板......”。

9、“.....根据平板上具有荧光变色圈的单菌落数与所有转化子的数量比得到阳性重组率。阳性重组率橄榄油罗丹明平板上具有荧光变色圈的单菌落数橄榄油罗丹明平板所有的单菌落数。农业水利论文酵母成型脂肪酶筛选方建的组成型表达菌株点种于橄榄油罗丹明平板上,培养,在紫外光下观察单菌落变色圈情况。单插入和双交换筛选库的构建利用定向进化技术建立的基因突变文库的质量将对后续的实验结果有重大影响。为考察单插入与双交换这两种不同的整合方式对整个建库的影响,将经酶切的线性化对照质粒和经酶切的线性化重组质粒分别通过单插入和双交换方式整合进毕赤酵母基因组中,同时保证这两种线性化质粒的量基本相同,进行电转化。将获得的诱导型转。由此得出,双交换整合得到的表型菌株转化效率和阳性重组率满足了后续建库的容量需求,并且能稳定的保证转化子的单拷贝状态,大大削减了多拷贝基因重组子的数量......”。