扩散，食品与药物管理机构已禁止在重组菌生产中使用抗生素和含抗药性基因作为筛选标志的载体质粒。染色体质粒平衡致死系统是近年来发展起来的类以非抗生素作为筛选标记的载体表达系统，它的宿主菌通常是类染色体管家基因的突变体，该缺陷型菌株不能在基本培养基上生长，当导入带有其完整基因的互补质粒后，质粒与缺陷型菌株即以遗传互补的方式构成染色体质粒平衡致死系统，此时互补质粒对其宿主菌的生长起到功能性互补的作用，旦质粒丢失，细菌则由于不能合成必需物质而死亡。基于减毒沙门氏菌染色体上基因的已知序列，利用噬菌体的同源重组系统步法构建沙门氏菌的基因缺失突变株，在二次重组中利用携带能够表达位点特异性重组酶基因的质粒介导二次同源重组，以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合扩增和测序结果，证明沙门氏菌缺失突变株的正确构建。另外，从沙门氏菌基因组中扩增出基因片段，将该片段整合到带有表达荧光蛋白基因的质粒中，命名为。缺失突变株失去了在普通培养基上生长的能力，只有添加或导入含有基因的质粒才能在培养基上生长，与原型沙门氏菌比较，其生长速度和生长对数期接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相致，基于该缺失突变株构建出以营养基因为标志的沙门氏菌染色体质粒平衡致死系统。关键词沙门氏菌受体菌重组系统基因缩略语及英汉对照氨苄青霉素氯霉素食品和药物管理局二氨基庚二酸基因双蒸水三磷酸脱氧核糖核苷细菌基础培养基小时分钟毫升毫摩尔摩尔聚合酶链式反应每分钟转数秒核糖核酸微升微摩尔，前言减毒沙门氏菌载体系统的研究进展减毒细菌活载体疫苗减毒沙门氏菌活载体疫苗的应用减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的机制沙门氏菌的减毒研究意义与目的研究内容技术路线材料与方法实验材料试剂和仪器毒株细胞菌株及质粒培养基试剂的配制仪器和器材方法减毒鼠伤寒沙门氏菌缺失株的构建菌株与质粒引物设计基因的制备含位点和基因的同源重组片段的制备和纯化沙门氏菌电转感受态细胞的制备重组酶质粒的转化和诱导表达基因的敲除沙门氏菌的鉴定氯霉素抗性基因的去除含的双启动子互补表达载体的构建表达载体的构建策略载体构建所用引物重组质粒的构建质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达质粒在中的体外遗传稳定性实验结果与分析减毒鼠伤寒沙门氏菌缺失株的构建基因的制备含位点和基因的同源重组片段的制备同源重组菌的鉴定重组菌沙门氏菌的鉴定重组质粒的构建及鉴定片段的扩增基因的扩增重组质粒的鉴定重组质粒在鼠伤寒沙门氏菌中的表达质粒在中的体外遗传稳定性重组菌表达产物的分析讨论参考文献致谢附录华南农业大学本科专业毕业论文成绩评定表前言减毒沙门氏菌载体系统的研究进展减毒细菌活载体疫苗载体疫苗是将所需的编码病原特异性抗原的片段插入减毒的活细菌或病毒载体，以提呈表达所编码的抗原，以期达到预防种或多种疾病的作用。重组细菌疫苗载体大多数利用共生细菌或者减毒的病原菌作为载体，利用减毒病原菌作为载体，可以同时产生针对异源抗原和载体病原菌的免疫反应。减毒细菌活载体疫苗因其能够刺激机体产生针对活载体及其携带的外源抗原的体液细胞免疫和局部粘膜免疫受到人们的广泛关注。减毒细菌通过口服进入机体，诱导机体产生针对特定抗原的各种免疫应答。减毒细菌通过突变其些致病基因，使其毒性降低，由于减毒的微生物仍有定的感染性，可以模拟天然的疾病发生过程，通过口服，进入肠道相关淋巴组织，因此可以全方位地激活机体免疫系统，从而产生粘膜免疫应答及全身免疫应答王芳，。目前些病原菌，如李斯特菌沙门氏菌耶尔森菌志贺氏菌及分支杆菌己经被广泛用作载体菌携带外源抗原，而些有益的微生物也成功地被用做载体，如乳酸菌为载体的疫苗，它们可以以食物的形式进入体内，也可以通过阴道途径进行免疫童光志，。减毒细菌活载体疫苗的优点培养方便，生产成本相对低廉，适用于大范围内的免疫接种免疫方法简便易行，可以通过口服和鼻腔接种高效的免疫原性，能够刺激机体的全身免疫可以携带较大的基因片段，易于构建多价疫苗。减毒沙门氏菌活载体疫苗的应用沙门氏菌是寄生于人类和动物肠道，内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。沙门氏菌无芽胞，无荚膜，多数有菌毛，鞭毛。沙门氏菌是肠杆菌科的重要病原菌属，到年为止已发现种血清型，。沙门氏菌属分为两个种名，分别是和，其中又分为六个亚种。绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性，能引起人和动物的多种不同临床表现的沙门氏菌病。年首次从鼠身上分离出鼠伤寒沙门氏菌年证实该菌可引起食物中毒，明确了该菌可以使人鼠共同致病。鼠伤寒沙门氏菌是种侵袭性胞内菌，表达外源抗原的减毒沙门氏菌经口服免疫后，能激发机体产生分泌型抗体体液免疫和细胞免疫并已应用于细菌，病毒，寄生虫，肿瘤，等疫苗的研制。沙门氏菌还可以成功地把疫苗转移至细胞内，。野生型沙门氏菌对机体有毒性作用，通过突变沙门氏菌毒力基因的方式构建减毒沙门氏菌菌株，限制其致病性，可以提高沙门氏菌作为基因及其产物传递工具的安全性。正是这些特性使减毒沙门氏菌成为种具吸引力的，能够将外源抗原转至哺乳动物免疫系统的表达载体。减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的机制沙门氏菌进入体内的途径有两种种是以细胞为代表的上皮细胞途径，另种是非上皮细胞途径。具有侵袭力的沙门氏菌可选择性地侵入派伊尔结，的细胞。细胞是年在粘膜淋巴结的滤泡相关上皮，中发现了种特殊的扁平上皮细胞，因其表面有微小的皱褶，又称微皱褶细胞赵燕等，。沙门氏菌入侵细胞后被抗原呈递细胞捕获然后再与相关免疫细胞相互作用，从而产生免疫应答或造成机体感染。沙门氏菌还可通过吞噬细胞直接吞噬的非上皮细胞途径侵入机体。等发现吞噬细胞可在肠道直接吞噬沙门菌并将其运送至脾脏，。等发现具有细菌摄取能力，通过打开肠道上皮间的紧密连接，直接进入肠腔吞噬沙门菌，。沙门氏菌被巨噬细胞或者树突状细胞吞噬后，方面刺激机体产生免疫应答，方面被转运到到达肠系膜淋巴结和血液并被脾脏和肝脏的巨噬细胞吞噬，在肝脏和脾脏会形成多细胞的感染病灶，从而形成持续感染并持续刺激机体产生免疫应答。减毒的沙门氏菌，最终会被宿主清除。沙门氏菌的减毒由于沙门氏菌是人畜共患病原菌，野生型沙门氏菌会引起人和动物肠热症胃肠炎败血症等。因此应用其作为疫苗载体之前需要作减毒处理，减少病原菌对动物宿主的致病性。同时当其致病性大时，更容易激起身体的免疫反应，导致机体清除病菌，降低疫苗载体在肠道内生存的时间。减毒株感染宿主细胞后可在体内长期存活并诱导产生保护性免疫反应。早期减毒手段是利用化学物质诱变和紫外线照射，这两种手段具有很大的盲目性，且由于引起的往往是点突变，因此极易产生回复突变。随着对沙门氏菌毒力因子和免疫机理的深入了解以及重组技术的发展，在沙门氏菌染色体基因组上随机插入个转座子或删除突变段或几段基因片段的减毒手段已广泛应用姜娜徐引第，。目前已研制出许多新的遗传确定的新型减毒株作为口服活疫苗的候选菌株，包括营养缺陷型突变株热休克蛋白酶缺陷株腺苷酸环化酶缺陷株毒力调控缺失株，。染色体质粒平衡致死系统染色体质粒平衡致死系统又叫载体宿主平衡致死系统，其宿主菌由于管家基因的突变或缺失，导致细菌不能合成必需的营养物质，因而不能在基本培养基上生长，必须在添加相应营养物质后方可生长。当带有其管家基因的互补质粒导入缺陷型宿主菌后，载体宿主构成遗传互补，缺陷型宿主菌可在无特殊营养物质添加的基本培养基上生长。由于宿主菌依赖互补质粒才能生长，旦质粒丢失，细菌因不能合成必需的物质，不能在基本培养基上生长。应用营养选择标志，该系统无需使用抗生素标记即可使外源基因在宿主菌中稳定表达。传统的表达载体通常带有抗药基因，为了使质粒稳定遗传，必须使用抗生素作为选择压力。但是，按照美国食品与药物管理机构的规定，活疫苗中不能存在抗药质粒，且在人和动物体内，无法以抗生素来维持重组质粒的稳定性。因此，在活载体疫苗中使用染色体质粒平衡致死系统携带和表达外源基因，更具安全性和稳定性。应用同源重组技术，科研人员己成功构建了伤寒沙门氏菌属的营养缺陷株，其中以基因和基因构建的平衡致死系统得到了广泛使用。基因负责编码天冬氨酸半醛脱氢酶，是细菌的赖氨酸苏氨酸甲硫氨酸二氨基庚二酸合成途径中的种关键酶，。二氨基庚二酸是构成革兰氏阴性细菌细胞壁上的肽聚糖的基本成分，缺少将导致细胞的裂解和死亡。在基本培养基和动物体内无的存在，因此基因可用于构建染色体质粒平衡致死系统。年，等建立了以基因为选择标志的染色体质粒平衡致死系统。首先构建了基因缺失的菌株，将表达基因的质粒转化至基因缺失鼠伤寒沙门氏菌中，构成互补系统并能高效和稳定的表达外源基因，。基因编码胸腺嘧啶核苷酸合成酶，该酶是从头合成途径中的关键酶，催化向转化，的缺失导致