姓名李怡导师赵玉平副教授年月日烟台大学烟台大学毕业论文任务书院系化学生物理工学院姓名李怡学号毕业届别专业食品科学与工程毕业论文题目酵母菌生物降解山楂汁中有机酸的研究指导教师赵玉平学历博士职称副教授所学专业发酵工程具体要求认真查阅相关资料，弄清实验目的意义，搞好整体设计。认真探索实验方法，找出实验关键。熟练实验操作技术，保证实验数据的准确性。实验数据真实可靠，文献引用要合理，论文撰写要规范。主要内容从天然果皮中富集分离纯化筛选出不同酵母菌，并接种到相同，不同体积的山楂汁中，山楂汁主要含柠檬酸，通过摇瓶培养，测定总酸柠檬酸黄酮含量的变化，比较酵母菌降酸情况并分析讨论，分离出能够有效降解柠檬酸且保留黄酮的菌种。主要参考资料沈萍微生物学实验北京高等教育与出版社，进度安排第周确定论文题目，布置文献查阅相关事宜，写开题报告。第周进行实验并记录实验数据第周实验数据整理分析第周论文写作指导教师签字年月日院系意见教学院长主任签字年月日备注摘要山楂汁中主要含有的是柠檬酸，文章主要从天然水果皮中通过微生物的富集分离纯化，筛选出不同种类的酵母菌，并将它们接种到山楂汁中，摇瓶培养，观察检测它们柠檬酸的生物降解的情况。并得到种或几种既能很好的降解酸又能保持山楂汁中黄酮含量稳定的酵母菌菌种。关键词山楂汁酵母菌柠檬酸黄酮生物降解，前言实验材料菌种的筛选与鉴定菌种的选择菌种的来源筛选方法山楂汁的制作实验方法山楂汁的降酸发酵柠檬酸的测定黄酮的测定实验结果分析与记录菌种的筛选分析酵母菌的富集培养分析山楂汁的降酸发酵分析柠檬酸分析黄酮分析高效液相色谱图分析实验结果结论致谢参考文献烟台大学毕业论文前言山楂蔷薇科，苹果亚科，山楂属植物，别名山里果红果。多指其果实。可食用，质硬，肉薄，味酸涩。山楂的产地很广，遍及大江南北，主要有山东河南浙江湖北等地，多为秋季采摘食用。自古以来，山楂具有非常重要的药用价值，中医常视之为治病良药，主治开胃健脾活血化痰消食化滞收敛止痢伤风感冒胸膈脾满食欲不振儿童缺铁性贫血症儿童软骨缺钙症等。山楂中含有多种对人体有益的营养成分，如淀粉糖类蛋白质脂肪胡萝卜素维生素苹果酸枸杞酸铁和钙的物质。山楂的所含物质还能够通过增强心肌收缩力扩张冠状动脉血管增加心脏血液输出量降低心肌耗氧量增加冠状动脉血流量等有效地降血脂血压和强心抗心律不齐心绞痛等功效。但是，起关键作用的是山楂中的黄酮类物质。目前，已经从山楂中分离出余种黄酮成分，有含碳键的黄酮苷类双氧黄酮苷类黄酮醇及其苷类聚合黄酮类。黄酮类化合物具有抗氧化抗肿瘤抗突变和保护心血管的多种特殊的生物功能作用，是植物化学物近些年的研究热点。正因为它维护心脑血管的如此功效，在应用中就要尽可能地保留黄酮类物质等重要成分，在改善色香味等口感的基础上，使山楂类产品更能为广大消费者所接受。在山楂汁的制作过程中最显著的特点就是山楂汁所含有的大量有机酸，如柠檬酸酒石酸苹果酸山楂酸咖啡酸绿原酸齐墩果酸等。它们的含量限制了对山楂的有效利用。因此，文章就是要利用生物化学或者物理化学的方法降解其中的有机酸，提高其值，并保留其黄酮含量的稳定。山楂汁的降酸方法有很多，如稀释降酸法酒石酸沉淀法碳酸钙沉淀法吸附树脂降酸法碱中和法电渗析法等物化方法和微生物在有氧条件厌氧条件下的发酵降酸。其中，物化方法虽简单易行，降酸作用显著，但是对山楂汁的其它成分的影响较大，很难平衡其组成，在生产试验当中达不到理想效果。而这篇文章主要介绍微生物在有氧条件下对山楂汁降酸情况的研究且以柠檬酸含量为检测标准，通过有效的手段分析比较然后筛选出保留黄酮的酵母菌，并测定它的降酸情况，观察其形态及生长规律。烟台大学毕业论文实验材料菌种的筛选与鉴定菌种的选择自然界中能够利用柠檬酸的微生物分布广泛，种类繁多，有细菌酵母菌霉菌等。相比于细菌霉菌，酵母菌的优势在于其低的高生长活力各个阶段生长非常有规律新陈代谢各个环节条理明晰，且产物菌体易于分离，符合现代提倡的安全卫生的操作管理理念此外，酵母菌菌体及其菌体蛋白，还能充分回收利用，广泛用于其它工业化生产工艺，如细胞工程发酵工程酶工程等等，是资源配置优化的种手段。天然存在的酵母菌通常具有以下个特点单细胞状，多营出芽生殖，发酵糖产能，壁多含甘露聚糖，于含糖高酸度大的水生环境中生存。其中，以柠檬酸作碳源彻底氧化分解或经糖异生途径利用柠檬酸转化为另种物质能同化柠檬酸的酵母菌据文献记载有多种。因此，从酵母菌中筛选出能够降解柠檬酸的菌种是可能的，而理想的目的菌种应具有以下种特征通过自身代谢分解总酸中的柠檬酸，使上升。保留黄酮等生物活性物质。不影响山楂汁风味或优于山楂汁风味。能提供山楂汁生产过程所需的些诱导物或酶等。菌体易分离获取。菌种遗传物质稳定，抗逆性强，不易变异。菌体能回收用于其它生产。初级次级代谢产物不产生抗生素毒素过敏原等对人体健康有害的物质。发酵后废液经处理不造成环境污染。菌种的来源酵母菌分布在自然界偏酸含糖的环境中，如水果花树皮和果园土壤中。实验小组人分别搜集了烟台山楂莱阳梨海南芒果南方菠萝这种水果的若干表皮组织且编号为，用以分离天然降酸的菌种。培养基的选择与配制富集培养基柠檬酸，硫酸铵，硫酸镁，磷酸二氢钾，酵母膏，氯化钠，无水氯化钙，溶于去离子水中。固体分离培养基琼脂，硫酸铵，硫酸镁，酵母膏，磷酸二氢钾，氯化钠，无水氯化钙，将其溶于去离子水中同时，将柠檬酸溶于水中湿热灭菌约，冷却至，混合，取洁净灭菌培养皿，倒平板。保存培养基葡萄糖琼脂各取，蛋白胨，酵母膏。筛选方法烟台大学毕业论文预处理分别取面积为未经清洗的新鲜水果皮样品于的锥形瓶中，每个瓶中各加入经湿热灭菌冷却后的富集培养基，并放入摇床，室温下摇瓶培养，观察培养液的浑浊程度。浑浊程度是菌体数量的客观反映。因为，刚接入培养基时，微生物需要进入个调整期，产生相应的酶系，才能进步生长繁殖所以，若与前天相比浊度变化不太明显，方面是微生物处于适应阶段，未出现繁殖现象，另方面是果皮上的微生物种类不能利用该培养基，不适应该环境，不能生长。当出现以上情况时，则需要再培养，观察并记录现象。相反，若培养液变浑浊了，且散发出淡淡的酒香，则应取出静置至澄清，视情况取定体积的上清液，弃去废液。菌种富集分别取上述种预处理上清液各于锥形瓶中，每个瓶中各加入经湿热灭菌冷却后的富集培养基，室温下摇瓶培养，同预处理方式样，观察记录培养液的浑浊程度。依次富集转接富集，相同条件下连续转接培养次后，酵母菌即成为优势菌种。此后，需根据菌体的数量级确定菌种分离的稀释倍数。菌体的计数方法采用血球板计数法，该法属于显微镜直接计数法，操作步骤大致为用无菌吸管吸取少许适当稀释后的酵母菌液，从计数板盖玻片端注入，菌液渗入其中后静置几分钟，用吸水纸吸去多余菌液，最后显微镜观察计数。通常取血细胞计数板个中方格的总菌数再求得每个中方格的平均值，该值乘上或就得出整个大方格中的总菌数，然后再换算成菌液中的总菌数，即菌液中总菌数以个中方格计数板为例，为总菌数，为稀释倍数。菌种分离稀释涂布平板法吸出稀释后的菌液于培养皿中，使用玻璃涂棒均匀涂抹在固体培养基上。平板划线分离法使用接种环挑取悬液环在培养基上划线分离，完毕后，盖上培养皿盖。上述操作均在无菌环境下进行，温室培养，获得单个菌落。观察比较菌落的不同特点并编号。保存采用冰箱保藏法或石蜡油封藏法保存菌种。菌种鉴定翻阅文献，对照菌种的相关特征然后归类。山楂汁的制作市售山楂鲜果，产地为山东烟台。选取其它实验材料和仪器为山楂果果胶酶打酱机恒温水浴锅加热锅离心机烧杯。取鲜山楂果若干，经清洗后选择完好无损成熟饱满色泽鲜亮的果子加水，并加热保温或煮沸，其中经过预煮程序能使山楂充分吸水，破坏山楂中的酶成分，防止固有营养成分的分解。然后打浆冷却至左右，加入果胶酶，混匀保温酶解，最后离心得山楂汁。经消毒灭菌后，常温或低温密闭保存。烟台大学毕业论文实验方法山楂汁的降酸发酵在第次富集转接培养时，每天测定总酸，培养，记录富集培养基中各培养基中总酸的变化情况。取和的山楂汁各份分别倒入相同规格的锥形瓶作为个实验小组，然后将分离纯化培养后的其中种酵母菌接种到这两瓶山楂汁中，室温下，摇瓶培养左右，测定山楂汁中柠檬酸的变化情况。取种等量不同种类的菌液，分别接种在相同规格的锥形瓶的山楂汁中，室温下，摇瓶培养，测定山楂汁中黄酮的变化情况。柠檬酸的测定采用酸碱滴定法测定，标准液的配制用小烧杯在电子天平上称取固体氢氧化钠，加蒸馏水，待氢氧化钠完全溶解，冷至室温后倒入容量瓶，加水至刻度，摇匀，备用。然后用配好的氢氧化钠标准溶液滴定邻苯二甲酸氢钾水溶液至微红色，且半分钟内不褪色为止。记录消耗氢氧化钠的毫升数和使用邻苯二甲酸氢钾的克数并计算氢氧化钠溶液的当量浓度，保存标液。用移液管取山楂汁样品于锥形瓶中，加入去离子水稀释，加滴至滴酚酞指示剂。用已标定的氢氧化钠标准溶液滴定样品至微红色且半分钟内不褪色为止。记录氢氧化钠标准溶液消耗量。以中和样品中柠檬酸为标准，计算柠檬酸的含量。采用高效液相色谱法测定流动相使用超纯水电阻率配制成磷酸二氢铵溶液，并用浓调至，然后用的纤维素膜进行超滤，超声波脱气。标准有机酸溶液的配制和标准有机酸图谱的制作标准有机酸采用柠檬酸酒石酸草酸乳酸苹果酸乙酸，分别用流动相配制成浓度为的标准样品溶液并配制浓度分别为的柠檬酸标准样品溶液。然后制作单酸的标准峰图和混合酸的标准峰图。样品处理精确吸取样品后，用乙醇沉淀大约，超声后，以离心，取上清液置于干燥箱里在下直至乙醇完全蒸发，取出干燥后表面皿，加入流动相，将固形物全部洗下之后，经微孔滤膜超滤利用高效液相色谱仪进行测定。色谱条件色谱柱选用流动相的流速为柱温为紫外检测波长为进样量为。黄酮的测