增个管家基因，有个型分别是，其中和是最主要的型。结论本院临床分离的鲍曼不动杆菌标本来源主要来自于痰液，主要分离的科室是，对多种药物耐药情况严重，多重耐药菌的比例居高不下。本院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物和氨基糖苷类药物的耐药水平比较高，耐药现象严重，和基因分别是碳青霉烯类药物和氨基糖苷类药物耐药的主要原因，其中基因介导氨基糖苷类药物的高水平耐药。本研究通过杂交实验表明和这两个基因可能位于染色体上，它们通过垂直传播的方式传播其耐药性。本研究通过和对和基因阳性的菌株的流行病学分析结果表明这种菌株在院内存在着克隆播散现象，其中和为主要流行的型，为主要流行的克隆复合体。关键词鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶甲基化酶温州医科大学硕士学位论文,。甲基化酶是介导氨基糖苷类药物高水平耐药的主要原因，年在日本家医院分离出来的铜绿假单胞菌中首次发现，近年来，陆续在世界各地不同菌株中检出，迄今已发现种甲基化酶基因，包括。并且这些基因主要位于细菌的质粒上，通过接合和转座子的形式造成耐药菌株的播散。目前在鲍曼不动杆菌中报道主要甲基化酶基因是，并且基因所在的位置国内报道较为少见。为了解碳青霉烯酶基因和甲基化酶基因的分布及基因特点，我们对温州医科大学附属第医院临床分离的鲍曼不动杆菌进行研究。材料与方法材料菌株来源实验菌株为年临床分离的非重复鲍曼不动杆菌，共株药敏试验质控菌株大肠埃希菌，购自卫生部临检中心实验中阳性对照为本实验室鉴定测序并保存菌株。脉冲场凝胶电泳标准菌株由浙江大学附属邵逸夫医院俞云松教授惠赠。抗菌药物亚胺培南美罗培南庆大霉素阿米卡星妥布霉素等抗菌药物的标准品购自中国药品生物制品鉴定所。主要仪器设备超净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司隔水式恒温培养箱上海跃进医疗器械厂型细菌比浊仪法国梅里埃有限公司微量移液器德国有限公司型全自动微生物分析仪法国梅里埃有限公司型全自动立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司Ⅱ型纯水进水型超纯水机上海优普实业有限公司温州医科大学硕士学位论文精密试纸张家港宣洁环保科技有限公司型计上海仪电科学股份有限公司型雪花制冰机上海田枫仪器公司超低温冰箱青岛海尔电器厂型冰箱东宝电器有限公司型电热恒温水槽上海森信实验仪器有限公司涡旋混匀器金坛市医疗仪器厂华志电子天平美国电子有限公司超高速冷冻离心机美国有限公司型离心机美国有限公司分光光度计美国有限公司™仪美国有限公司稳压稳流电泳仪美国有限公司型多用途水平电泳槽北京百晶生物技术有限公司型凝胶成像系统美国有限公司隔水式恒温培养箱上海跃进医疗器械厂型比浊仪法国梅里埃有限公司微量移液器德国有限公司系统美国有限公司分子杂交仪型亚能生物技术有限公司光自动洗片机德国柯达洗片机主要试剂及溶液配置药敏所用溶液及培养基的配置配置血平板同第部分平板在电子天平上称取琼脂干粉,而后加入的蒸馏水，高压蒸汽灭菌后冷却至，倾注于无菌的平皿中，厚度约为,进行无菌试验，试验合格后冷藏备用。的生理盐水在电子天平上称取氯化钠，而后加入的蒸馏水，高压蒸汽灭菌后冷却。抗菌药物原液准确计算出所要称量出配置具体药物原液所需抗菌药物的质量，按照规定各种药物的溶解剂配置药物原液。所用试剂含日本公司所用引物上海生工公司合成温州医科大学硕士学位论文琼脂糖干粉法国公司上海生工公司所用溶液配置同第部分的琼脂糖凝胶配置同第部分质粒手工提取所用试剂氯化钠上海生工有限公司胰蛋白英国有限公司酵母提取物英国有限公司上海生工有限公司浓盐酸上海生工有限公司上海生工有限公司氢氧化钠上海生工有限公司葡萄糖温州长风有限公司苯酚上海生工有限公司氯仿上海生工有限公司异戊醇温州长风有限公司无水乙醇温州长风有限公司质粒手工提取所用溶液配置液体培养基同第部分生理盐水取至，高温高压灭菌后冷藏备用。称量置于烧瓶中加入约的浓盐酸，调节至，然后定容至。称量于烧杯中，加入约,充分搅拌均匀然后加入片剂片剂调节至。葡萄糖称取葡萄糖置于烧杯中加入蒸馏水定容至。称取置于烧杯中,加入溶解常温下不易溶解，置于，用定容到。分次量取片剂边加水边搅拌，定容至。质粒提取液取和葡萄糖。加入定容至。质粒提取液取加入定容至，室温保存备用。质粒提取液称取醋酸钠置于的烧杯中，量取的冰醋酸温州医科大学硕士学位论文加至上述溶液中，用定容至。平衡苯酚取出苯酚后室温平衡，待平衡后再放入水浴中，使苯酚液化溶解。取上述液态苯酚加入等体积的,用玻璃棒充分搅拌约分钟后静置去除水相，重复上步骤，去除水相后棕色瓶中保存。苯酚氯仿异戊醇溶液取氯仿和异戊醇混合，在上述混合物中加入平衡苯酚,置于棕色瓶中，室温下避光保存。质粒试剂盒提取所用试剂联科生物技术有限公司乙醇温州长风有限公司异丙醇上海生工和所用试剂上海生工氯化钠温州长风有限公司上海生工公司去氧胆酸上海生工十二烷基肌氨酸钠上海生工硼酸上海生工冰醋酸上海第试剂厂溴化乙锭公司蛋白酶温州长风有限公司限制性内切酶核酸酶日本公司低熔点胶美国有限公司胶体金美国有限公司和所用溶液配置准确称取碱，硼酸加入蒸馏水定容至。准确称取碱蒸馏水定容至,用片剂调节至。缓冲液准确称取,氯化钠,去氧胆酸,十二烷基肌氨酸钠,蒸馏水定容至,最后用调节至。溴化乙锭在中加入,混合至完全溶解，保存。杂交所用试剂和试剂盒电泳胶回收试剂盒凯杰生物技术有限公司温州医科大学硕士学位论文罗氏地高辛探针标记试剂盒罗氏公司马来酸温州长风有限公司氯化钠温州长风有限公司上海生工温州长风有限公司柠檬酸钠上海生工浓盐酸上海第试剂厂氢氧化钠上海生工温州长风有限公司杂交所用溶液的配置称取于蒸馏水中，加入浓盐酸,定容至，调。变性液准确称取和，加入蒸馏水。中和液称取，加入,后加入蒸馏水定容至。称取氯化钠和柠檬酸钠，而后加入蒸馏水定容至，用片剂调至。洗涤缓冲液准确称取马来酸,氯化钠,。加入蒸馏水定容至。马来酸缓冲液准确称取马来酸，氯化钠。加入蒸馏水定容至,加片剂调至至。检测缓冲液准确称取,氯化钠，加蒸馏水至,加入片剂调至至。封阻液准确量取马来酸缓冲液后加入号瓶地高辛杂交试剂盒。抗体溶液工作液准确量取的封阻液和的号管地高辛杂交试剂盒。显色液量取检测液后加入的号管地高辛杂交试剂盒注在暗室中配置准确称取,柠檬酸钠，和，加蒸馏水定容至。准确称取，柠檬酸钠和，加蒸馏水定容至。方法琼脂稀释法测定鲍曼不动杆菌对主要的碳青霉烯类药物和氨基糖苷类药物菌株培养实验前天将实验菌株和大肠杆菌接种于哥伦比亚血琼脂平板上，培温州医科大学硕士学位论文分类号单位代码学号硕士学位论文论文题目鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶和甲基化酶基因及流行分布研究生姓名学科专业临床检验诊断学类型学术型指导教师二四年五月温州医科大学硕士学位论文论文题目鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶和甲基化酶基因及流行分布答辩委员会主席胡松年教授答辩委员会成员田宇清教授包其郁教授论文答辩日期年月日温州医科大学硕士学位论文目录缩略词表中文摘要英文摘要前言第部分年间临床分离鲍曼不动杆菌的耐药特性材料和方法结果分析与讨论第二部分鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶和甲基化酶基因研究材料和方法结果分析与讨论第三部分和基因阳性鲍曼不动杆菌分子流行病学分析材料和方法结果分析与讨论全文小结正文参考文献附录致谢综述综述参考文献论文独创性声明温州医科大学硕士学位论文缩略词表缩写英文全称中文全称美国典型菌种保藏中心基本局部联配搜索工具碱基对临床实验室标准化研究所脱氧核糖核苷三磷酸溴化乙锭超广谱内酰胺酶小时中介鲁利亚培养基分钟金属内酰胺酶水解酪蛋白最低抑菌浓度多位点序列分型美国国家生物技术信息中心苯唑西林酶脉冲场凝胶电泳聚合酶链反应耐药秒敏感十二烷基硫酸钠秒冰醋酸电泳缓冲液硼酸电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷温州医科大学硕士学位论文鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶和甲基化酶基因及流行分布中文摘要目的了解温州医科大学附属第医院年来临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药情况分析鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶和甲基化酶的基因分布及特征探究碳青霉烯酶和甲基化酶的基因阳性菌株的同源性，为院内感染管理与控制提供理论依据。方法回顾性分析年间温州医科大学附属第医院临床分离鲍曼不动杆菌的感染分布和耐药情况测定鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物和氨基糖苷类药物的方法筛查鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶耐药基因和甲基化酶的基因。通过手工和试剂盒方法提取鲍曼不动杆菌的质粒，并通过和杂交的方法确定基因染色体或质粒的位置。通过脉冲场凝胶电泳和多位点序列分析的技术对和基因阳性的菌株进行同源性研究，了解其流行特点。结果年温州医科大学附属第医院临床分离的株鲍曼不动杆菌标本来源主要为痰液，占,其次为创面，占，血液，占，其他标本如腹水尿液脑脊液导管引流等占。病区的分布主要以科室为主占,其次为神经外科和脑外科占，烧伤科占。鲍曼不动杆菌的耐药现象非常严重，除左氧氟沙星和头孢哌酮舒巴坦耐药率在以下外，其它药物的耐药率都达到了很高的水平，碳青霉烯类如亚胺培南和氨基糖苷类药物如阿米卡星耐药率都接近。扩增类碳青霉烯类金属酶基因及类碳青霉烯酶基因,和甲基化酶基因,其中基因的阳性率分别为和。并且通过杂交表明和基因可能定位于细菌染色体上。携带基因和基因阳性的菌株对碳青霉烯类药物和氨基糖苷类药温州医科大学硕士学位论文物的耐药达到了很高的水平，对碳青霉烯类药物的和分别为和，对氨基糖苷类药物阿米卡星庆大霉素和妥布霉素的和都，耐药现象严重。株同时携带和基因的鲍曼不动杆菌有三个主要克隆群。其中克隆为株，克隆为株，克隆为株，克隆为最主要的克隆群。选取三个主要克隆菌株通过扩增个管家基因，有个型分别是，其中和是最主要的型。结论本院临床分离的鲍曼不动杆菌标本来源主要来自于痰液，主要分离的科室是，对多种药物耐药情况严重，多重耐药菌的比例居高不下。本院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物和氨基糖苷类药物的耐药水平比较高，耐药现象严重，和基因分别是碳青霉烯类药物和氨基糖苷类药物耐药的主要原因，其中基因介导氨基糖苷类药物的高水平耐药。本研究通过杂交实验表明和这两个基因可能位于染色体上，它们通过垂直传播的方式传播其耐药性。本研究通过和对和基因阳性的菌株的流行病学分析结果表明这种菌株在院内存在着克隆播散现象，其中和为主要流行的型，为主要流行的克隆复合体。关键词鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶甲基化酶温州医科大学硕士