件进行优化，为实现果胶酶的国产化提供定的理论依据。刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件材料与方法材料菌株由试验筛选得到。果胶美国公司，马铃薯市售，硝酸铵，硫酸钠，硫酸镁，氯化钾，硫酸铁，磷酸氢二钾，硝酸钠，牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，硫代硫酸钠，碘，碘化钾，可溶性淀粉，硫酸铵，蔗糖，葡萄糖等均为甘肃中瑞试剂公司提供。仪器设备微量移液器，上海雷勃分析仪器有限公司，摇床，金坛市恒丰仪器厂，高温灭菌锅型，上海绿宇精密仪器制造有限公司，水浴锅型，上海申胜生物技术有限公司，电磁炉，烧杯，试管，培养皿，接种针，酒精灯，碘量瓶，酸式滴定管等。试验方法发酵条件优化酶活测定参考孙越陈静,方法，进行酶活测定酶液制备将发酵液于，离心后取上清液作为粗酶液。果胶溶液配制取果胶粉，加热溶解，煮沸，冷却后过滤，调节值，定容至。酶活测定取两个三角瓶，个为酶液瓶瓶，个为空白瓶瓶，并分别在瓶瓶中各加入果胶溶液，瓶加重蒸馏水和酶液后调值至，瓶加重蒸馏水，水浴后立即加热煮沸并冷却。取上述瓶瓶中溶液各，分别加入另外两个三角瓶刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件瓶中，各加浓度为的碳酸钠溶液摇匀，再各加浓度为碘碘化钾溶液于两个三角瓶中，摇匀，加塞，放置后，分别吸取浓度为硫酸加入上述两个三角瓶中，用硫代硫酸钠滴定至淡黄色时停止滴定，加入浓度为的淀粉指示剂，此时溶液呈蓝色，继续滴定至蓝色消失为止，分别记下消耗硫代硫酸钠的体积数。结果计算将每小时酶促催化果胶分解成游离的半乳糖醛酸所需的酶量定义为个酶活性单位，具体计算公式如下活性单位数毫升酶液式中空白消耗硫代硫酸钠溶液体积试样消耗硫代硫酸钠溶液体积硫代硫酸钠摩尔浓度摩尔硫代硫酸钠相当于游离半乳糖醛酸反应液体积吸取反应液体积反应时间发酵培养基最佳配方及条件的选择根据单因素试验结果，选择对果胶酶产酶水平影响显著的碳源，氮源，表面活性剂，发酵培养基初始和发酵温度五个因素进行二次回归正交旋转组合设计试验，通过测定果胶酶活力，确定最佳的发酵培养基配方。试验因子水平及编码见表。表因素水平编码表码值因素数据分析根据试验结果，采用建立五元二次回归方程以确定最佳试验条件并对相关性强的两因素的交互作用进行响应面分析。验证试验根据试验得到的数据，进行产果胶酶菌株的发酵试验，以验证最佳生产工艺条件。刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件结果与讨论产酶条件优化利用二次回归正交旋转组合设计方案对菌株进行发酵条件的优化，其试验组合及结果见表。表五因素二次回归正交旋转组合实施试验结果表处理号结果刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件五元二次回归方程的建立及检验根据试验结果，采用计算各项回归系数，以建立菌株产酶酶活与碳源，氮源，表面活性剂，发酵培养基初始和发酵温度五因子的数学回归模型应。由图可以看出，碳源和温度对产酶的影响较大。当碳源浓度处于低水平时，随着的升高，菌株产酶性能逐渐提高当碳源浓度处于高水平时，随着的升高，菌株产酶性能逐渐降低。当值较低时，随着碳源浓度的升高菌株产酶性能逐渐升高当值较高时，随着碳源浓度的增加，菌株产酶性能急剧降低。这可能是由于在低条件下，碳源可以逐渐水解成微生物容易利用的小分子营养物质另外，由于菌株产生的酶为酸性水解酶，过高会影响酶的活性，造成菌株产酶性能降低。刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件图碳源和发酵培养基初始值对产酶的交互作用分析由图可以看出，当碳源浓度处于较低水平时，随着发酵温度的升高，菌株的产酶性能先急剧上升，随后缓慢下降当碳源浓度处于较高水平时，随着发酵温度的升高，菌株的产酶性能先缓慢上升，再急剧下降。当温度较低时，随着碳源浓度的提高，菌株的产酶性能逐渐升高当温度较高时，随着碳源浓度的增加，菌株的产酶性能迅速降低。图碳源和发酵温度对产酶的交互作用分析由图可以看出，当表面活性剂浓度处于零水平附近时，温度对菌株产酶性能影响微弱。当表面活性剂处于较低水平时，随着温度的升高，菌株的产酶性能急剧升高，当表面活性剂浓度处于较高水平时，随着温度的升高，菌株的产酶性能急剧下降。这可能因为低浓度的表面活性剂可促进胞内酶的外渗，从而使菌株的产酶性能提高。刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件图表面活性剂和温度对产酶的交互作用分析发酵条件的优化及验证采用对方程进行求解，得出极大值点及极大值。试验结果如下发酵碳源浓度发酵氮源浓度表面活性剂浓度发酵初始发酵温度，在此条件下菌株理论产酶活性可以达到。通过验证试验得到菌株实际产酶性能为，两者相差不大。结论菌株产酶性能优化条件的数学回归模型为此模型能在试验范围内准确测得微生物产酶性能的条件。通过因素之间的交互作用分析可以得出碳源与发酵培养基初始，碳源与温度，表面活性剂与温度的互作效应对菌株的产酶效果影响显著。菌株发酵最优条件为发酵碳源浓度发酵氮源浓度表面活性剂浓度发酵初始发酵温度，在此条件下菌株理论产酶活性可以达到。通过验证试验得到菌株的实际产酶性能为，两者相差不大。刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件参考文献王璋食品酶学北京轻工业出版社罗仓学,张长青果胶酶制剂对草莓汁澄清作用的研究青海大学学报自然科学版全桂静果胶酶高产霉菌的筛选及固体发酵条件的优化沈阳化工学院学报邱雁临,王金华果胶酶对山楂酒澄清的研究湖北农业科学杨军,梅艳黑曲霉果胶酶在苹果汁澄清中的应用研究湖北农业科学赵丽莉微生物果胶酶研究及其在果蔬加工中的应用进展,张树政酶制剂工业下册北京科学出版社尤华,陆兆新,冯红霞微生物原果胶酶的研究进展工业微生物杨天波微生物学通报崔福绵果胶酶菌株的选育及其液体发酵条件的研究微生物学报杜国军产果胶酶黑曲霉的筛选及诱变育种农业与技术孙越果胶酶活性的测定方法食品科技,陈静,王淑军,杨从发,等果胶酶产生菌的选育淮海工学院学报,刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件致谢本论文是在韩舜愈教授的悉心指导下完成的。他从论文的选题到论文的审阅和定稿都付出了大量的心血。导师在科学探索中所表现出的敏锐洞察力和严谨的治学态度以及丝不苟的敬业精神，给我留下深刻印象，会使我终生受益，在此特向导师致以深深的敬意和诚挚的感谢。试验过程中还得到了祝霞老师王媛师姐巩亚莉同学的亲切指导和热心帮助，谢谢你们,正是有了你们的帮助，试验才进行的更加顺利。在这里并向四年来所有帮助与关心支持过我的老师和同学们表示衷心的感谢,本科毕业论文论文题目应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件学院食品科学与工程学院专业食品科学与工程毕业届别届姓名刁望强指导教师韩舜愈职称教授甘肃农业大学教务处制二〇〇九年六月刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件目录前言材料与方法材料仪器设备试验方法发酵条件优化验证试验结果与讨论产酶条件优化五元二次回归方程的建立及检验试验因子间交互作用分析发酵条件的优化及验证结论参考文献,致谢刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件刁望强甘肃农业大学食品科学与工程学院级食科班摘要本试验通过五元二次回归正交旋转组合设计对果胶酶的发酵条件进行了优化，并建立了其产酶性能优化条件的数学回归模型。试验结果表明碳源与发酵培养基初始，碳源与温度，表面活性剂与温度的互作效应对菌株产酶效果影响显著。菌株的最适发酵碳源浓度发酵氮源浓度表面活性剂浓度发酵初始发酵温度，在此条件下菌株产酶活性可以达到。关键词果胶酶正交旋转组合发酵条件优化前言果胶质是植物产生的结构性多糖，广泛存在于高等植物的组织中，尤其是水果和蔬菜组织的细胞间质和细胞初生壁中。果胶质属异多糖，分子量在，主要由半乳糖醛酸经,糖苷键连接成直链状聚合物，部分半乳糖醛酸上的羧基可与甲醇酯化形成甲酯。果胶即为甲酯化的多聚半乳糖醛酸物质，其分子中约羧基是被甲酯化的。果胶按其分子中半乳糖醛酸上羧基的酯化程度不同，可分为低甲酯果胶酯化度和高甲酯果胶酯化度。果胶酶是指能分解果胶质的多种酶的总称，不同来源的果胶酶其特点也不同，微生物来源的果胶酶主要有聚半乳糖醛酸酶，聚半乳糖醛酸裂解酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶和果胶酯酶。在果胶酶系中发现较早，它可以水解半乳糖醛酸,糖苷键，产物为单半乳糖醛酸和二半乳糖醛酸通过切断果胶分子,糖苷键，生成具有不饱和键的半乳糖醛酸酯可以切断果胶分子,糖苷键，产物为个糖醛酸单位的不饱和甲基半乳糖酸低聚物能使果胶中的甲酯水解，生成果胶酸和甲醇。果胶酶的应用十分广泛。例如可降低果汁粘度，澄清果汁果酒，从而保持产品的稳定性，同时，果胶酶还可保持果粒的完整性有些果蔬榨汁较困难，若先刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件用果胶酶处理，可使果蔬汁粘度下降，有利于过滤和浓缩，提高出汁率，改善成分果胶酶还可以应用于水果和蔬菜的浸解液化，生产单细胞果蔬汁果胶酶还可用于果实脱皮。由于含有纤维素酶和半纤维素酶的粗果胶酶制剂能作用于果实皮层，使细胞分解而脱落。橘子囊衣莲子内皮和大蒜膜层经果胶酶处理后可以很快脱落砍伐后的木材常对防腐剂如杂酚油或铜铬硼的处理有抗性。经果胶酶制剂或产果胶酶细菌处理后，木材的通透性增加，从而加强了防腐剂的使用效果麻类植物中除含有纤维素果胶半纤维素木质素等，还含有胶类物质即非纤维类物质，占麻类成分的，纺织时须去除。常用的化学脱胶法操作条件较复杂，且会产生大量废水。我国土法脱胶就是将麻浸入池塘或河沟，利用存在于麻类植物本身或水中的细菌等微生物产生的果胶酶分解果胶。此外，果胶酶还可应用于棉织物精炼加工。等人发现碱性果胶酶可使原果胶水解成为可溶于水的高聚合度的果胶分子，从而开发了种针对棉织物精练的生物化学工艺，并称之为生物精练。国内对果胶酶的研究始于世纪年代。八十年代以来我国学者对果胶酶菌种选育进行了大量的研究。杨天波等以碳黑曲霉为出发菌株，对孢子悬液进行紫外线和高能电子辐射复合处理，获得产酶能力提高的白色孢子突变株。崔福绵等以亚硝基胍处理黑曲霉，获得高产果胶酶突变株，此菌株在无锡酶制剂厂通过了中试，作为生产菌株进行批量生产。据杜国军等报道，以黑