分子量的蛋白质，显示该粗毒含有丰富的多肽组分通过粗毒的细胞毒活性，分析带斑狼蛛粗毒对白血病细胞前列腺癌细胞的细胞毒活性，结果显示该粗毒具有显著的抗癌细胞活性抗菌活性分析，带斑狼蛛粗毒对谷氨棒杆具有定的抑制活性。材料与方法材料三氟乙酸氰基羟基肉桂酸芥子酸乙腈过硫酸铵尿素琼脂糖甘油溴酚蓝丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺十二烷基磺酸钠和凝胶电泳标准蛋白质，细胞培养液，胎牛血清，胰蛋白酶。仪器设备离心机基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱超净工作台，恒温水浴锅，二氧化碳培养箱，冷冻离心机，真空冷冻干燥机，™旋转混匀仪，稳压电源，超低温冰箱中科美菱，倒臵显微镜，型低速离心机，蛋白质凝胶成像系统型水平摇床。溶液配制电泳的溶液浓缩胶缓冲液。过滤,保存。分离胶缓冲液。过滤，保存。上样缓冲液溴酚蓝，甘油。电极缓冲液，甘氨酸，。胶固定液甲醇，乙酸，水。蓝染色液先将溶于水中,溶解后加入考马斯亮蓝后充分搅拌。再加磷酸，定容至，搅拌后加甲醇，最后定容到，储存于棕色瓶内放于室温。脱色液冰乙酸乙醇蒸馏水溶液称取•溶于双蒸水中，用盐酸调值至，加水定容至，常温保存备用。培养基去离子水中加入胰化蛋白胨酵母提取物，摇动容器直至溶质溶解用调至用去离子水定容至在高压下蒸汽灭菌带斑狼蛛蜘蛛的毒素采集成年带斑狼蛛雌性个体从我国西南地区获得，被装入透明的广口塑料杯中，上面覆盖透光透气的纱布。带斑狼蛛在湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学研究室动物房人工饲养。每天喂水和虫子，这些保证了它们的正常存活和生活。这些蜘蛛不具有攻击性，但具有较快的反应速度逃逸，在喂食的过程中。电刺激的方式获得粗毒，电刺激法采集其毒液人将蜘蛛放在固定有铝片的塑料平台上，使蜘蛛腹部的尾端紧贴铝片，将洁净薄塑料片臵于蜘蛛的毒螯和口器之间。另人将电刺激器的两个电极分别放在铝片和螯肢的根部，电极用食盐水湿润，以增加导电性。蜘蛛在的电刺激下将无色透明的毒液分泌到薄塑料片上。塑料片接触口器的面用无水乙醇清洗以避免了消化液的掺入，对蜘蛛没有生命的伤害，每周次。只蜘蛛能够获得的毒液，约的干粉。粗毒冻干后保存于。反相高效液相色谱分离带斑狼蛛粗毒反相高效液相色谱在公司的仪器上进行，所用分析柱为反相柱，公司，检测器为光检测器。流动相为含的流动相为含的。洗脱梯度为流速检测波长为，柱温箱温度为。每次进样量均为粗毒冻干粉，收集各洗脱峰。粗毒预处理称取粗毒冻干粉，溶于，并于台式高速离心机上离心转速为沉淀不溶物。取上清液进样。所用乙腈梯度见表。并用质谱仪鉴定样品的纯度，目的样品的冻干粉末臵于冰箱储存备用。表反相高效液相色谱检测波长柱温时间流速曲线注曲线表示流动相梯度变化的速率，号曲线表示匀速直线性变到终条件基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定反向高效液相色谱各峰质谱分析在美国应用生物系统公司生产的型的质谱仪上进行。用℅℅乙腈℅水混合液制备基质，然后分别取的药理学作用。抗菌活性分析结果表明带斑狼蛛粗毒对金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，变形杆菌无抑制活性。说明带斑狼蛛粗毒对上述三种菌类的疾病无作用。对谷氨杆菌有较弱的抑制活性，浓度约抑制，说明带斑狼蛛粗毒对谷氨杆菌菌类引发的疾病可能有潜在的治疗效果。抗菌活性分析实验显示该粗毒对菌类的抑制作用不具有普遍性，不能作为广效性抗菌药。由于该实验只是粗略的进行其生理生化活性分析，因此要透彻的得知该毒素的作用机制还需进步的实验研究。蜘蛛毒素由毒腺分泌产生，是种包含了无机盐有机小分子﹤蛋白质和多肽的化学混合物，主要用于防御和捕食。蜘蛛产生各种神经毒素，除了神经毒素外，从蜘蛛毒素中也分离和鉴定到了些具有细胞毒活性抗菌活性凝集活性激肽类似物等非神经生物学活性的多肽毒素。研究发现多数细胞毒活性肽兼具抗菌活性和抗癌细胞活性抗病毒等活性。细胞毒活性肽与细胞膜作用有三种模型模型模型模型。三种模型分别描述了细胞毒活性肽可在细胞膜上形成离子通道跨膜孔道或导致大量的细胞膜破坏。与传统抗菌药物相比,细胞毒活性肽具有以下几个特点选择性作用，其对微生物的毒性要大大强于宿主细胞更短时间内杀灭细菌抗菌谱更广病原菌不易对其产生耐药性。同时，对新抗生素的需求大大加强了人们把具有抗菌活性的细胞毒活性肽作为新的治疗药物来进行研究的兴趣。已有若干细胞毒活性肽进入临床前和临床实验。文献表明黑寡妇蜘蛛毒素能够增强脑微血管内皮细胞的胞饮作用,破坏内皮细胞间的连接,使血脑屏障的通透性增加。等研究发现从眼镜蛇毒中分离出来的细胞毒素对黑色素瘤细胞和白血病细胞系具有选择性杀伤作用。从妩蛛科蜘蛛的毒液中分离出种毒性肽,能在细菌中对毒性肽进行基因表达。美国科学家格伦金等人从漏斗蛛体内提取种毒素，经过基因改造后它对害虫的杀伤力更强。正如前面所言，细胞毒活性肽及所含活性肽的特异性给开发和利用生物资源提供了许多机遇。目前多肽抗肿瘤药物的研发主要集中于治疗性疫苗细胞毒药物和靶向药物三种类型，这正好符合抗肿瘤药物的发展趋势。目前细胞毒药物是抗肿瘤药物的主流，占据了整个抗肿瘤药物的左右，因此筛选新型细胞毒药物仍是抗肿瘤药物研发的重点。近十多年来，随着分离纯化和分析鉴定技术的快速发展，为活性肽研究的迅速发展提供了前提条件而生物学分子生物学细胞学等基础研究的渗入，使得快速简便命中率高的活性筛选模型陆续建立和投入应用，无疑也极大地推动了细胞毒活性肽的研究。本研究为进步在该粗毒中分离和鉴定具有选择性抗癌细胞毒活性成分奠定了基础作用。因此，此方面工作的开展必定会为蜘蛛粗毒特别是带斑狼蛛抗癌的深入研究及今后的应用提供依据，也为将来开发出高效低毒的抗癌药物和发现更多此类细胞毒活性肽的研究打下坚实的基础。当然本实验还存在些不足之处，如缺少针对具体实验结果机理的研究分析，蜘蛛毒素量不够多，同时该实验研究中不同部分有不同人员完成，可能会有误差存在，实验结果仅仅是为以后相关实验作个参考。这些问题都有必要在今后的研究中进行改正，以使研究结果更具代表性和普遍指导意义。参考文献梁宋平，潘欣蜘蛛肽类神经毒素研究进展生物化学与生物物理进展，尹长民，张永强狼蛛属两新种记述蛛形目，狼蛛科广西农业大学学报，动物学研究间斑寇蛛粗毒的生理生化分析及两种采毒方法的比较,王建辉,谷维娜,朱宝成,蜘蛛多肽毒素研究进展蛛形学报,前小红，蛋白质组与生物质谱技术分析，质谱学报。陈主初，梁宋平主编，肿瘤蛋白组学高霞，陈惊秋多肽的抗菌活性和细胞毒性研究,,朱彭龄谢光华编著现代液相色谱时兰州兰州大学出版社,英辛普森主编许征帆译,实用高效液相色谱法，北京中国建筑丁业出版社,王俊德,商振华,郁蕴露编著高效液相色潜法北京中国石化出版社,湖南师范大学自然科学学报三种捕鸟蛛粗毒的和质谱分析附录致谢难忘四年的本科生活，值此论文完成之际，心中充满感激之情。带斑狼蛛粗毒的生理生化分析摘要本文描述的带斑狼蛛分布于我国西南地区，常见于稻田及湿地地带。带斑狼蛛毒液是种化学混合物，对该蜘蛛粗毒进行生物化学和生物学活性方面的分析，探究带斑狼蛛粗毒潜在的药用价值。主要实验步骤为反相高效液相向色谱分离得到各个组分基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，测定高效液相色谱分离峰的分子量聚丙烯酰氨凝胶电泳技术分析粗毒中的小分子量多肽与大分子量蛋白质粗毒的细胞毒活性分析，带斑狼蛛粗毒对白血病细胞前列腺癌细胞具有显著的细胞毒活性抗菌实验结果显示，该粗毒对金黄色葡萄球菌绿脓杆菌变形杆菌无抑制作用，但对谷氨酸棒状杆菌具有定的抑制活性。关键词带斑狼蛛粗毒高效液相色谱飞行时间质谱聚丙烯酰氨凝胶电泳细胞毒活性抗菌活性,绪论研究背景蜘蛛属于节肢动物门，蛛形纲，蜘蛛目，蜘蛛起源早种类繁多，分布广泛。全世界有近,种，我国大约有,种，如间斑寇蛛俗称黑寡妇蜘蛛虎纹捕鸟蛛海南捕鸟蛛中华狼蛛雷氏大疣蛛和漏斗网蛛等，在我国剧毒蜘蛛也有多种。蜘蛛通常以昆虫与哺乳动物为食，以蜘蛛毒液来麻痹和杀死猎物，同时蜘蛛毒液在消化过程中也起到预消化作用。另外，当蜘蛛遇到外来袭击时，也可以起到自卫作用。有些蜘蛛只有在自卫时才射毒，而在制服猎物时不使用毒液。神经毒素快速作用以麻痹猎物，长效神经毒素用来抑制猎物的分解，坏死性毒素及酶类可以让蜘蛛逐步消化猎物。不同种蜘蛛的毒液的成分不同，蜘蛛毒液成分较多，主要的成分有蛋白质多肽多胺类神经毒素酶核苷酸游离氨基酸单胺以及无机盐等物质。科学研究人员在蛇蝎和芋螺等动物毒液中发现许多有重要价值的专性神经毒素之后，蜘蛛毒成为神经毒素的新来源，而且蜘蛛毒液中特异性药物和毒素分子是科学研究者寻找农业杀虫剂的较好模式分子。蜘蛛毒素在药理学神经生物学和医学领域已展现出广阔的应用前景。些蜘蛛毒素如已被广泛用做工具试剂，而且蜘蛛毒素的进步研究必将推动这些领域的进步发展。毒素的主要作用是麻痹或杀死猎物，蜘蛛产生各种神经毒素，神经毒素根据化学结构分为蛋白多肽类神经毒素和多胺类神经毒素。其中多肽类神经毒素最重要，蜘蛛多肽类神经毒素根据功能和分子特征可分为两种类型第种是低分子量多肽类，能与兴奋性细胞膜上的阳离子通道相互作用第二种是高分子量多肽类，与突触前膜的受体组分及增强神经介质的分泌密切相关。蜘蛛多肽类神经毒素的分子量范围是到，含有多对半胱氨酸残基，形成二硫键，二硫键从到不等。作为种规则，含有相同数目的二硫键的毒素有着明显的结构同源性，但功能特征却不同。近年来，多肽类药物的开发已经成为大型跨国药企新药开发的主流。多肽类毒素作为颇具市场前景的药物先导分子倍受关注。蜘蛛物种资源丰富，且其多肽毒素有极大的多样性，这特点使得蜘蛛毒素成为获得多肽类毒素的理想来源。现有研究结果已经证实上述观点如从智利狼蛛中分离得到的种蛋白质是种有效的镇痛剂，用于抑制严重疼痛。从虎纹捕鸟蛛蛛粗毒中分离出种多肽神经毒素，虎纹镇痛肽，可通过对离子通道的阻断抑制痛觉的传递，起到镇痛作用。同时，蜘蛛毒液中含有丰富的抗菌肽，对革兰氏阴性菌阳性菌霉菌等许多细菌有明显的抑菌作用。本文描述的带斑狼蛛分布于我国西南地区，常见于稻田及湿地地带的。带斑狼蛛毒液是种化学混合物，对该蜘蛛粗毒进行生物化学和生物学活性方面的研究，探究带斑狼蛛粗毒是否具有的药用价值。研究主要技术方法包括反相高效液相色谱，基质辅助激光解析电离飞行时