性，否则判为阴性。若扩增产物与中发布的有关序列或参考序列参见附录的同源性高于以上，则判为阳性，否则判为阴性。荧光聚合酶链式反应狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚试剂犜犪狇酶，保存。含各，保存。苯酚氯甲烷无水乙醇乙酸钠，量试剂盒或，购于试剂公司。引物和探针引物引物探针器材微量振荡器或荧光仪及配套的毛细管微量加样器及配套的带滤芯吸头高速台式冷冻离心机离心速度犵以上的离心管生物安全柜超纯水系统等。模板。加入的无菌去离子水，充分混匀，犵以下然后加丙酮预冷固定，同时设正常细胞孔和感染了的细胞孔作为阴阳性对照。用孔清洗诊断板次，每次，最后弃去，在吸水纸上轻轻拍干。滴加工作浓度稀释倍的鼠源单克隆抗体，置于湿盒内，感作。清洗诊断板次，方法同。加入工作浓度稀释倍的兔抗鼠结合物，孔，置于湿盒内，感作。犛犖犜弃去板中液体，清洗次，方法同。荧光显微镜检查在放大条件下镜检，荧光显微镜采用蓝紫光波长。序列测定对扩增产物最好预先进行适当的浓缩进行序列测微镜。犛犖犜试剂培养液胎牛血清氨基葡萄糖青霉素和链霉素溶液。犘犆犞易感细胞细胞。犘犅犛见附录。病料采集无菌采集病死猪的腹股沟淋巴结脾肺肾等组织样品或病猪的抗凝血，保存，立即送检。若不能立即送检，应置以下条件保存备检。病毒分离将采集的组织样品用按∶的比例进行稀释，研磨成匀浆，或取病猪的抗凝血，反复冻融次后，犵离心，取上清液，经微孔滤膜过滤除菌，接种在无感染的正常细胞单层上，感作，倾尽接种液，加入含胎牛血清的培养液含的青霉素和的链霉素，继续培养猪圆环病毒病检疫技术规范.各，保存，避免反复冻融。琼脂糖。蛋白酶。十烷基磺酸钠。扩增引物外部引物对可以扩增的核苷酸序列，也可以扩增的核苷酸序列，扩增产物约为内部引物对只可以扩增的核苷酸序列，扩增产物约为。样品制备脏器组织采集病死猪的腹股沟淋巴结脾肺肾等组织样品，用按∶的比例稀释，研磨成匀浆，反复冻融次后，犵离心子水定容至。犛犖犜附录犆资料性附录犘犆犞基因组全序列犫狆及内外引物位点低温冰箱离心机及离心管组织研磨器的微孔滤膜普通光学显微镜。犛犖犜试剂培养液胎牛血清氨基葡萄糖青霉素和链霉素溶液。犘犆犞易感细胞细胞。犘犅犛见附录。病料采集无菌采集病死猪的腹股沟淋巴结脾肺肾等组织样品或病猪的抗凝血，保存，立即送检。若不能立即送检，应置以下条件保存备检。病毒分离将采集的组织样品用按∶的比例进行稀释，研磨成匀浆，或取病猪的抗凝血，反复冻融次后，犵离心，取上清液，经微孔滤膜过滤除菌，接种在无感染的正常细胞单层上，感作，倾尽接种液，加入含胎牛血清的培养剂单克隆抗体结合物胰蛋白酶丙酮。操作方法吸取接种过待检样品经胰蛋白酶消化的细胞，加入诊断板中，置超净工作台中风干，然后加丙酮预冷固定，同时设正常细胞孔和感染了的细胞孔作为阴阳性对照。用孔清洗诊断板次，每次，最后弃去，在吸水纸上轻轻拍干。滴加工作浓度稀释倍的鼠源单克隆抗体，置于湿盒内，感作。清洗诊断板次，方法同。加入工作浓度稀释倍的兔抗鼠结合物，孔，置于湿盒内，感作。犛犖犜弃去板中含的青霉素和的链霉素，继续培养，弃上清液，加入的氨基葡萄糖，作用，倾去，洗涤，再加入含胎牛血清的培养液含的青霉素和的链霉素，继续培养。病毒鉴定感染细胞后不产生明显的细胞病变效应，故需采用见或见等方法做进步的鉴定。间接免疫荧光试验犐犉犃器材诊断板荧光显微镜恒温箱保湿盒微量移液器等。猪圆环病毒病检疫技术规范。酶与缓冲液犜犪狇酶缓冲液。氯化镁。含序列测定对扩增产物最好预先进行适当的浓缩进行序列测定，然后运用适当的软件对测序结果进行同源性分析。结果判定在各对照组成立的条件下，以标准及阳性对照为基准，结束后若得到左右的电泳条带，则可初步判断为阳性，否则判为阴性。若扩增产物与中发布的有关序列或参考序列参见附录的同源性高于以上，则判为阳性，否则判为阴性。荧光聚合酶链式反应狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚试剂犜犪狇酶，保存。含各，保存。苯酚氯甲烷无水乙醇乙酸钠，犮狋狋犮狋犵犮犵犵狋犪犪犮犵犮犮狋犮犮狋犛犖犜。模板。加入的无菌去离子水，充分混匀，犵以下瞬时离心，置仪内开始反应。对照组的设置同时设置阴性对照阳性对照和空白对照。对照组反应体系中，除模板外其余组成成分与相同。反应条件两次的反应犘犮犪犪犮狋犵犮狋犵狋犮犮犮犪犵犮狋犵狋犪犵，取上清液置于的离心管内编号备检。值每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数细胞病变效应脱氧核糖核酸异硫氰酸荧光黄间接免疫荧光试验最低要求培养基分子量标记物巢式聚合酶链式反应猪圆环病毒型猪圆环病毒型猪肾传代细胞系磷酸盐缓冲液荧光聚合酶链式反应十烷基磺酸钠犜犪狇酶犜犪狇聚合酶检疫方法病毒的分离与鉴定器材孔或孔细胞培养板微量移液器恒温水浴箱氧化碳恒温箱普通冰箱及低温冰箱离心机及离心管组织研磨器的微孔滤膜普通光学含的青霉素和的链霉素，继续培养，弃上清液，加入的氨基葡萄糖，作用，倾去，洗涤，再加入含胎牛血清的培养液含的青霉素和的链霉素，继续培养。病毒鉴定感染细胞后不产生明显的细胞病变效应，故需采用见或见等方法做进步的鉴定。间接免疫荧光试验犐犉犃器材诊断板荧光显微镜恒温箱保湿盒微量移液器等。猪圆环病毒病检疫技术规范。酶与缓冲液犜犪狇酶缓冲液。氯化镁。含或，加蒸馏水溶解，最后定容至。犃犿狅犾犔狆犎磷酸盐缓冲液的配制液液氯化钠用蒸馏水定容至，高压灭菌后低温保存备用。犛犖犜附录犅规范性附录试剂配制犅的在双蒸水或去离子水中加入水乙胺乙酸钠，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液的值至约需氢氧化钠颗粒，然后定容至，分装后灭菌备用。犅缓冲液碱冰乙酸的犅缓冲液取的缓冲液，加灭菌双蒸水或去猪圆环病毒病检疫技术规范.件相同预变性。扩增，个循环。延伸。反应结束后取出反应管，犵以下瞬时离心，取扩增产物进行电泳分析。电泳分析取琼脂糖，加入的缓冲液见附录，配制的琼脂糖溶液。加热溶解，待冷却约后，在每琼脂糖溶液中加入的溶液或替代物，混匀，制备电泳凝胶。在凝胶孔内分别添加扩增产物需和上样缓冲液充分混合和犛犖犜分子量标记物，电泳电压约为后取琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统内进行分析。猪圆环病毒病检疫技术规犵狋犵犵犮犮狋狋犘犮犪犵狋犪狋犪狋犮犮犵犪犪犵犵狋犵犮犵犵合和犛犖犜分子量标记物，电泳电压约为后取琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统内进行分析。反应条件预变性。扩增个循环，在退火延伸时收集各循环的荧光。反应结束后，根据荧光曲线和值判定结果。结果判定结果分析条件设定直接读取检测结果。阀值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整，以阀值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准。质控标准阴性对照无值或值，并且无扩增曲线。阳性对照值，并且出现典型的扩增曲线。若阴阳性对照组结果不成立，则视为无效试验。结果描述与判定若检测样品的值或无值，并犘狋犪犵犵狋狋犪犵犵犵犮含的青霉素和的链霉素，继续培养，弃上清液，加入的氨基葡萄糖，作用，倾去，洗涤，再加入含胎牛血清的培养液含的青霉素和的链霉素，继续培养。病毒鉴定感染细胞后不产生明显的细胞病变效应，故需采用见或见等方法做进步的鉴定。间接免疫荧光试验犐犉犃器材诊断板荧光显微镜恒温箱保湿盒微量移液器等。猪圆环病毒病检疫技术规范。酶与缓冲液犜犪狇酶缓冲液。氯化镁。含子水定容至。犛犖犜附录犆资料性附录犘犆犞基因组全序列犫狆及内外引物位点，均为分析纯，保存备用。乙醇，保存备用。荧光定量试剂盒或，购于试剂公司。引物和探针引物引物探针器材微量振荡器或荧光仪及配套的毛细管微量加样器及配套的带滤芯吸头高速台式冷冻离心机离心速度犵以上的离心管生物安全柜超纯水系统等。无扩增曲线，则判为阴性。若检测样品的值，并且出现典型的扩增曲线，则判为阳性。若检测样品的值介于之间，但扩增曲线显著，或值，但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检。若复检后，结果无变化，则判为阳性若复检后，值，无扩增曲线，或值介于之间，但扩增曲线不显著，或值，则判为阴性。犛犖犜附录犃规范性附录磷酸盐缓冲液犘犅犛配方以下所用试剂均为分析纯。试验用水应符合规定。犃犃液犿狅犾犔磷酸氢钠水溶液磷酸氢钠，溶于蒸馏水中，最后定容至。犃犅液犿狅犾犔磷酸氢钠水溶液磷酸氢钠或猪圆环病毒病检疫技术规范.瞬时离心，置仪内开始反应。对照组的设置同时设置阴性对照阳性对照和空白对照。对照组反应体系中，除模板外其余组成成分与相同。反应条件两次的反应条件相同预变性。扩增，个循环。延伸。反应结束后取出反应管，犵以下瞬时离心，取扩增产物进行电泳分析。电泳分析取琼脂糖，加入的缓冲液见附录，配制的琼脂糖溶液。加热溶解，待冷却约后，在每琼脂糖溶液中加入的溶液或替代物，混匀，制备电泳凝胶。在凝胶孔内分别添加扩增产物需和上样缓冲液充分子水定容至。犛犖犜附录犆资料性附录犘犆犞基因组全序列犫狆及内外引物位点，然后运用适当的软件对测序结果进行同源性分析。结果判定在各对照组成立的条件下，以标准及阳性对照为基准，结束后若得到左右的电泳条带，则可初步判断为阳性，否则判为阴性。若扩增产物与中发布的有关序列或参考序列参见附录的同源性高于以上，则判为阳性，否则判为阴性。荧光聚合酶链式反应狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚试剂犜犪狇酶，保存。含各，保存。苯酚氯甲烷无水乙醇乙酸钠，均为分析纯，保存备用。乙醇，保存备用。荧光弃上清液，加入的氨基葡萄糖，作用，倾去，洗涤，再加入含胎牛血清的培养液含的青霉素和的链霉素，继续培养。病毒鉴定感染细胞后不产生明显的细胞病变效应，故需采用见或见等方法做进步的鉴定。间接免疫荧光试验犐犉犃器材诊断板荧光显微镜恒温箱保湿盒微量移液器等。猪圆环病毒病检疫技术规范。试剂单克隆抗体结合物胰蛋白酶丙酮。操作方法吸取接种过待检样品经